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马腺疫(strangles)是由马腺疫链球菌(Streptococcus equi subspecies equi, S.equi)引起的具有高度传染性的马属动物鼻咽症状为特征的疾病，该病可导致马匹的死亡，在世界范围影响着马业的发展，近年来也对新疆地区马养殖业造成了较严重的经济损失。EAG蛋白是马腺疫链球菌表面重要的IgG结合蛋白，参与该菌的免疫逃避作用。目前对该菌EAG蛋白的变异与致病和免疫关系的研究较少，为认识该基因在疾病流行过程中的变异情况，评价其在马腺疫链球菌的致病和免疫过程的作用，本研究对EAG基因克隆和比较分析后，对得到的突变体蛋白重组表达，以建立小鼠和马模型，对该蛋白的免疫生物学特性进行了初步的探究。
本研究扩增克隆了EAG基因的3种突变体：EAG5012、EAG823和EAGHT1112基因片段，并分别构建重组原核表达载体。诱导表达并纯化后得到分子量为25kDa左右的EAG重组蛋白(EAG823，EAGHT1112和EAG5012)，三种蛋白经WesternBlot检测均有较好的免疫原性。将纯化的三种EAG蛋白和SeM、IdeE2蛋白分别单独和联合免疫小鼠与马后，ELISA检测各免疫组抗体水平和亚型，结果表明EAG5012和EAGHT1112免疫组抗体效价(1: 72 900)显著高于EAG823免疫组(1: 24 300)。SeM、IdeE2和EAG5012联合免疫组抗体效价最高达1:218700。各免疫组抗体亚型检测结果产生的亚型以IgG1和IgG3为主，IgG1水平最高。
以S.equi5012菌株攻击小鼠，并对攻击后小鼠保护率、体重变化、心肝脾肺肾荷菌量进行检测，结果表明EAG5012免疫组保护率为86.7%，高于EAGHT1112组的保护率80%和EAG823免疫组的保护率为66.7%。SeM+IdeE2+EAG5012联合免疫组保护率为87%。各脏器荷菌量检测结果显示，EAG5012免疫组荷菌量显著低于EAG823和EAGHT1112免疫组，SeM+IdeE2+EAG5012联合免疫荷菌量显著低于单独免疫组(P<0.05)，SeM+IdeE2+EAG5012联合免疫组效果最佳。
以小鼠脾淋巴细胞检测各免疫组诱导淋巴细胞活化增殖情况。结果显示三种EAG重组蛋白均能刺激小鼠淋巴细胞活化，EAG5012组刺激小鼠脾淋巴细胞增殖率最高，达到150%，显著高于EAG823免疫组(120%)。SeM+IdeE2+EAG5012联合组的刺激指数最高(160%)，显著高于各个单独免疫组。
利用ELISA法检测免疫后小鼠血清中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12和IL17A等细胞因子的表达水平和马血清中IFN-γ、IL-4、IL-6和IL-10细胞因子分泌情况。结果表明攻击后小鼠和马血清中细胞因子的表达量显著增多，EAG5012免疫组这些细胞因子的表达量显著高于EAG823和EAGHT1112免疫组。SeM+IdeE2+EAG5012联合免疫组小鼠和马的细胞因子表达量高于单独免疫组。
马多形核中性粒细胞(PMN)吞噬抑制检测结果表明，EAG5012重组蛋白对PMN吞噬S.equi的抑制作用强于重组蛋白EAG823和EAGHT1112，重组蛋白EAGHT1112的抑制作用强于EAG823，且抑制效果与蛋白浓度呈正相关。SeM+IdeE2+EAG5012联合应用时抑制作用强于各蛋白的吞噬抑制作用。各种不同蛋白的特异性抗体介导马PMN调理吞噬结果表明，EAG5012特异抗体调理吞噬的作用优于EAG823抗体组和EAGHT1112抗体组，SeM+IdeE2+EAG5012联合免疫的抗体调理吞噬作用显著优于各自单独的抗体。
综上所述，S.equi的3种不同EAG突变体具有明显差异的免疫生物学特性，当SeM，IdeE2和EAG5012联合免疫时可小鼠模型和本体动物马有较好的免疫效果，该研究能够为亚单位疫苗的研究和马腺疫的防控提供实验依据。
本研究扩增克隆了EAG基因的3种突变体：EAG5012、EAG823和EAGHT1112基因片段，并分别构建重组原核表达载体。诱导表达并纯化后得到分子量为25kDa左右的EAG重组蛋白(EAG823，EAGHT1112和EAG5012)，三种蛋白经WesternBlot检测均有较好的免疫原性。将纯化的三种EAG蛋白和SeM、IdeE2蛋白分别单独和联合免疫小鼠与马后，ELISA检测各免疫组抗体水平和亚型，结果表明EAG5012和EAGHT1112免疫组抗体效价(1: 72 900)显著高于EAG823免疫组(1: 24 300)。SeM、IdeE2和EAG5012联合免疫组抗体效价最高达1:218700。各免疫组抗体亚型检测结果产生的亚型以IgG1和IgG3为主，IgG1水平最高。
以S.equi5012菌株攻击小鼠，并对攻击后小鼠保护率、体重变化、心肝脾肺肾荷菌量进行检测，结果表明EAG5012免疫组保护率为86.7%，高于EAGHT1112组的保护率80%和EAG823免疫组的保护率为66.7%。SeM+IdeE2+EAG5012联合免疫组保护率为87%。各脏器荷菌量检测结果显示，EAG5012免疫组荷菌量显著低于EAG823和EAGHT1112免疫组，SeM+IdeE2+EAG5012联合免疫荷菌量显著低于单独免疫组(P<0.05)，SeM+IdeE2+EAG5012联合免疫组效果最佳。
以小鼠脾淋巴细胞检测各免疫组诱导淋巴细胞活化增殖情况。结果显示三种EAG重组蛋白均能刺激小鼠淋巴细胞活化，EAG5012组刺激小鼠脾淋巴细胞增殖率最高，达到150%，显著高于EAG823免疫组(120%)。SeM+IdeE2+EAG5012联合组的刺激指数最高(160%)，显著高于各个单独免疫组。
利用ELISA法检测免疫后小鼠血清中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12和IL17A等细胞因子的表达水平和马血清中IFN-γ、IL-4、IL-6和IL-10细胞因子分泌情况。结果表明攻击后小鼠和马血清中细胞因子的表达量显著增多，EAG5012免疫组这些细胞因子的表达量显著高于EAG823和EAGHT1112免疫组。SeM+IdeE2+EAG5012联合免疫组小鼠和马的细胞因子表达量高于单独免疫组。
马多形核中性粒细胞(PMN)吞噬抑制检测结果表明，EAG5012重组蛋白对PMN吞噬S.equi的抑制作用强于重组蛋白EAG823和EAGHT1112，重组蛋白EAGHT1112的抑制作用强于EAG823，且抑制效果与蛋白浓度呈正相关。SeM+IdeE2+EAG5012联合应用时抑制作用强于各蛋白的吞噬抑制作用。各种不同蛋白的特异性抗体介导马PMN调理吞噬结果表明，EAG5012特异抗体调理吞噬的作用优于EAG823抗体组和EAGHT1112抗体组，SeM+IdeE2+EAG5012联合免疫的抗体调理吞噬作用显著优于各自单独的抗体。
综上所述，S.equi的3种不同EAG突变体具有明显差异的免疫生物学特性，当SeM，IdeE2和EAG5012联合免疫时可小鼠模型和本体动物马有较好的免疫效果，该研究能够为亚单位疫苗的研究和马腺疫的防控提供实验依据。