论文部分内容阅读
贝氏柯克斯体是Q热的病原体，为专性细胞内寄生菌，是一种重要的通过空气传播的生物战剂和生物恐怖剂。本研究旨在对贝氏柯克斯体的27kDa、30kDa、34kDa外膜蛋白和热休克蛋白60B亚单位（HSPB）等保护性抗原进行研究，为抗Q热分子疫苗的研制奠定基础。 1．贝氏柯克斯体27kDa、30kDa、34kDa外膜蛋白和HSPB基因的克隆与序列分析 用PCR从贝氏柯克斯体Xinqiao株（中国分离株）和Henzerling株（意大利分离株）的基因组中分别扩增到27kDa、30kDa、34kDa、HSPB蛋白基因片段，将这些基因片段进行了克隆和测序。用基因分析软件将获得的Xinqiao株和Henzerling株的基因序列及基因序列所推导氨基酸序列与已知Nine Miles株（美国分离株）的基因序列进行比较。3株贝氏柯克斯体的27kDa、30kDa、34kDa、HSPB蛋白基因序列的相似性均在99.1％以上，氨基酸序列的相似性均在97.4％以上，证明这些抗原在贝氏柯克斯体菌株中是十分保守的。 用基因分析软件对贝氏柯克斯体Xinqiao株的27kDa、30kDa、34kDa、HSPB蛋白基因序列所推导的氨基酸序列的B细胞和T细胞表位进行预测，结果显示这些蛋白均具有多个B细胞和T细胞表位，推测的结果提示这些蛋白可以有效地诱导机体产生特异性体液和细胞免疫。 2．贝氏柯克斯体保护性抗原基因重组原核表达质粒的构建和用重组蛋白的免疫小鼠 将PCR扩增的贝氏柯克斯体Xinqiao株27kDa、30kDa、34kDa、HSPB蛋白基因分别与原核表达质粒pQE30重组，构建了pQE／27、pQE／30、pQE／34、pQE／hspB重组原核表达质粒；在IPTG诱导下，这些重组质粒转化的大肠杆菌分别产生了27kDa、30kDa、34kDa、HSPB重组蛋白。免疫印迹证明这些重组蛋白均能与贝氏柯克斯体感染小鼠血清反应，提示这些蛋白能够诱导机体产生特异性体液免疫。 用亲和层析法纯化的27kDa、30kDa、34kDa、HSPB重组蛋白，用它们分别免疫小鼠（BALB／c）1次，加强免疫1次。加强免疫后的第28天，采集免疫小鼠血清检测血清特异性抗体和取免疫小鼠脾细胞作体外淋巴细胞增殖试验。结果证明这些重组蛋白均能诱导机体产生特异性体液和细胞免疫。 加强免疫后的第28天，用10ID50贝氏柯克斯体腹腔接种攻击免疫小鼠，7天后对受攻击小鼠作贝氏柯克斯体载量和病理学检查。结果发现非免疫组小鼠的肺、肝脏、脾脏均有严重病变，脾脏有大量的贝氏柯克斯体存在；除27kDa蛋白免疫组的肺、脾脏有较严重病变，以及某些小鼠的脾脏观察到少量贝氏柯克斯体外，30kDa、34kDa、HSPB蛋白免疫组的小鼠的主要脏器未发现明显病理改变和只有个别小鼠的脾脏观察极少量的贝氏柯克斯体。综合评价提示30kDa、34kDa、HSPB重组蛋白免疫效果比27kDa好。虽然30kDa蛋白免疫小鼠的特异性抗体水平最低，但是它们的特异性细胞免疫水平较高和抗感染能力强，提示细胞免疫在抗贝氏柯克斯体感染中起关键作用。 将免疫效果较好的30kDa和34kDa蛋白的基因融合，构建pQE／30-34原核表达质粒，SDS-PAGE和免疫印迹证明该质粒转化的大肠杆菌产生较高水平的30-34kDa融合蛋白。用纯化的30-34kDa融合蛋白免疫小鼠，免疫小鼠的血清中检测到高水平的抗30kDa和抗34kDa蛋白抗体，其体外淋巴细胞增殖军事医学科学院博士学位论文博士生魏文进导师温博海研究员水平也比单个蛋白免疫小鼠的高。攻击后的免疫小鼠的脾脏贝氏柯克斯体检测和主要脏器的病理学检查等证明30一34kDa融合蛋白免疫比30kDa或34kDa蛋白的免疫效果好。 3.贝氏柯克斯体保护性抗原基因的重组真核表达质粒的构建和用重组真核表达质粒免疫小鼠 用贝氏柯克斯体30kDa蛋白基因和HSPB基因分别构建了单个基因重组的真核表达质粒（pcDNA/3口、PcDNA/力印口），并将这2个基因融合构建了双目的基因重组的真核表达质粒（pcDNA/3O叻印刀）。用重组真核表达质粒分别转染真核细胞（COS一7），用3OkDa和HSPB蛋白免疫血清分别对转染的细胞作间接免疫荧光染色，结果证明30kDa蛋白基因、HSPB基因以及它们的融合基因均在相应的转染细胞内表达了目的蛋白。 用重组真核表达质粒分别免疫小鼠2次，ELISA检测的免疫小鼠的血清特异性抗体水平并不高，但pcDNA/30--h印B免疫小鼠体外淋巴细胞增殖水平高于p。DNA/30或pcDNA/hSPB免疫的小鼠。贝氏柯克斯体攻击后免疫小鼠的脾脏贝氏柯克斯体载量和病理学检查结果显示poDNA/30一印B的免疫效果比PcDNA/3口或pcDNA/h胡B的免疫效果好。在2次重组真核表达质粒免疫之间加1次同源重组蛋白免疫，结果显示该免疫小鼠的特异性抗体水平和体外淋巴细胞增殖水平明显高于单独重组质粒免疫组，免疫保护效果也显著好于单独重组质粒免疫组。