背景原发性甲状旁腺功能亢进症（Primary Hyperparathyroidism,PHPT,甲旁亢）是由于甲状旁腺本身病变引起的甲状旁腺素（parathyroid hormone,PTH）过多导致的钙、磷代谢紊乱的代谢性骨病。大部分PHPT为散发性（sporadic PHPT,SHPT）,少数（<10%）病例为家族性或综合征性。目前关于PHPT患者的遗传学研究多基于一代测序技术,对特定年龄或临床表型患者进行某一个或少数几个PHPT致病基因的检测,结果可能存在选择偏倚,可能遗漏临床表现不典型的遗传性/综合征性PHPT病例;且在中国人群PHPT患者中遗传性PHPT所占比例及构成情况尚缺乏明确的数据。此外,新发现的PHPT致病基因GCM2基因在中国人PHPT发病机制中的作用尚无相关研究。目的本课题拟通过应用高通量DNA测序技术对本中心新诊断PHPT患者进行系统性的致病基因筛查:1、了解中国人PHPT患者中遗传性/家族性PHPT所占比例及病因构成,结合变异基因型进一步分析临床表型特征;2、探索PHPT新致病基因GCM2在中国人PHPT发病机制中的作用,总结GCM2变异相关PHPT的临床特征。3、进一步了解本中心MEN1相关的PHPT（MHPT）患者遗传背景及临床特征。对象和方法1、在2015年8月～2019年8月于北京协和医院内分泌科就诊的新诊断的PHPT汉族患者中,连续纳入同意进行基因检测的患者,应用目标区域靶向二代测序技术（Panel包含基因:MEN1、RET、CDKN1B、CαSR、HRPT2/CDC73、GNA11、AP2S1、GCM2）联合MEN1-MLPA和CDC73-MLPA进行PHPT致病基因的筛查,依据ACMG进行罕见变异的致病性分类。根据临床表现、家族史及基因检测结果,筛查家族性/综合性PHPT,比较遗传性PHPT与非遗传性PHPT的临床特征差异。应用体外双荧光素酶报告基因实验对GCM2罕见变异进行体外功能验证,并对携带GCM2基因胚系激活性变异的PHPT病例临床特点进行总结。2、纳入1984年1月～2020年1月于北京协和医院内分泌科就诊的MHPT病例,应用Sanger测序技术及目标区域靶向二代测序技术对MHPT患者进行筛查,对于明确诊断MHPT但基因筛查阴性患者,进一步完善MLPA检查;匹配同时期临床散发的PHPT患者,比较MHPT与散发性PHPT患者临床特征差异。3、临床资料部分采用回顾性病历复习,收集一般情况、PHPT相关临床表现及生化指标、遗传性PHPT临床评估、影像学检查及病理结果,应用双能X线吸收仪（GE-Lunar）测定面积骨密度,同版本TBS软件（iNsightv2.1）计算骨小梁分数。结果本研究分别纳入394例连续诊断的汉族PHPT患者用于第一、二部分研究;120例MHPT患者及同时期临床散发性PHPT患者360例用于第三部分研究。1.单中心大样本量PHPT患者致病基因筛查及临床特征总结（1）PHPT患者基因变异谱394例患者二代测序共发现103例患者携带79种罕见非同义变异,在41例患者中共检出37种致病性或可疑致病性变异,检出率为10.4%,其中27个为新发现的变异。通过MLPA进一步筛查出3例大片段缺失,将检出率提升至11.2%（44/394）。另有30例临床诊断MEN1的患者,其中19例携带MEN1-VUS变异,11例未携带MEN1罕见非同义变异。联合基因筛查和综合征性PHPT相关临床筛查,本研究遗传性PHPT诊断率为 18.8%（74/394）。（2）遗传性PHPT组和非遗传性PHPT组临床特征的比较遗传组患者74例,非遗传组患者262例（除外临床诊断的综合征性PHPT患者及所有罕见变异携带者）。遗传组患者就诊年龄及起病年龄均显著低于非遗传组患者（就诊年龄:43.6±14.0vs.53.7±14.9,起病年龄:35.4±13.8vs.50.6±14.8,P值均<0.001）,男性所占比例明显高于非遗传组（44.6%vs.24.0%,P<0.001）。遗传组患者游离钙及血β-CTX水平较高,但血清总钙、PTH等其他指标均无显著差异。病理方面,遗传组患者甲状旁腺增生及多腺体受累所占比例显著高于非遗传组。（3）突变组与非突变组临床特征的比较突变组患者63例,共包括44例患者携带致病性/可疑致病性变异（包含3例携带大片段缺失患者）,另有19例临床诊断为MEN1患者携带MEN1-VUS变异;非变异组患者269例（除外所有罕见变异携带者）,两组组间差异与前述遗传组和非遗传组大致相同,但突变组病理除增生外,腺癌比例也显著高于非突变组。（4）提示遗传性PHPT的相关因素分析对提示遗传性PHPT的相关因素（起病年龄、性别、是否为无症状患者、血游离钙、血清总钙、PTH和是否多腺体受累）进行二分类logistic回归分析,结果表明当其他变量保持不变时,多腺体受累患者相较于单腺体受累患者,患遗传性PHPT的优势比为6.175倍;起病年龄每增加1岁,优势比为0.967倍。进一步对年龄进行诊断切点计算,分段线性模型计算结果提示患者约在35岁时患病风险概率发生较大改变,ROC曲线结果提示患者起病年龄≤38岁时敏感性大于80.53%,起病年龄≥49岁时特异性大于81.08%。2、PHPT患者GCM2基因胚系变异功能验证及临床特征分析394例患者中共发现12例患者携带GCM2基因罕见变异,其中共5例患者携带4种GCM2罕见错义变异,分别为c.488A>G（p.E163G）,c.1162A>G（p.K388E,n=2）,c.1144G>A（p.V382M）和c.1247A>G（p.Y416C）。双荧光素酶报告基因功能实验提示位于高度保守区域（CCID区:aa 379-395）的两个变异（p.K388E和p.V382M）与GCM2转录功能的激活相关,分别使转录活性升高为野生型的1.79倍和1.74倍（P<0.05）。5例（男性/女性:4/1）携带GCM2错义变异患者的平均诊断年龄52.0±15.6岁,中位血钙3.04（3.00,3.30）mmol/L,中位PTH427.0（250.3,647.0）pg/mL,所有患者均接受甲状旁腺探查+腺瘤切除术,携带p.K388E变异的2例患者及p.Y416C的1例患者病理诊断均为甲状旁腺癌,携带p.V382M变异的患者病理为非典型腺瘤。1例患者术后未缓解并且拒绝再次手术治疗,1例患者术后2年时出现原位复发,再次手术后缓解,其余3例首次术后即缓解且尚未复发（随访时间分别为4.5年、3年、4年）。3、MHPT患者MEN1基因胚系变异筛查及临床特征总结（1）MHPT患者MEN1基因胚系变异筛查120例临床诊断的MHPT患者中共103例携带78种MEN1基因变异,变异检出率85.8%。根据ACMG分级,51例患者携带致病性/可疑致病性变异（包含3例MEN1大片段缺失）,52例患者携带VUS变异,1例携带MEN1同义变异,5例携带其他基因VUS变异。移码变异和错义变异所占比例最高,未观察到热点变异区域。17例患者未携带MEN1基因罕见非同义变异,平均诊断年龄偏大（基因筛查阴性患者47.8±14.8岁vs.基因筛查阳性患者41.8±13.1岁,P=0.02）,其余临床特征与基因筛查阳性患者无显著差异。（2）MHPT患者与同时期SHPT患者临床特征比较MHPT患者120例,随机匹配同时期SHPT患者共360例。MHPT组包括50名男性,70名女性;中位年龄43.5（31.5,52.0）岁,较SHPT患者更为年轻（P<0.001）,男性所占比例也更高。MHPT患者最常见临床表现为肾结石/肾钙化,共65例（54.2%）,高于对照组的35.6%（P<0.001）;消化道及骨骼受累、血清总钙及游离钙、PTH等两组间均无统计学差异。MHPT组共96例（80.0%）患者行手术治疗,术后病理包括增生43例（44.8%）、腺瘤49例（51.0%）,另有3例不典型腺瘤及1例腺癌（4.2%）。13例（13.5%）患者术后未缓解,83例（86.5%）患者术后血钙及PTH降至正常,其中24例（24/83,28.9%）术后0.5年至15年间出现复发。（3）MHPT患者与年龄及性别匹配的SHPT患者骨骼受累情况比较MHPT患者共86例在我院进行了骨密度及TBS检查,随机匹配同年龄、性别、时期的SHPT患者86例。MHPT患者腰椎骨量及TBS均显著低于SHPT患者（骨量:0.91±0.18 g/cm2 vs.1.01±0.17 g/cm2;TBS:1.22±0.14 vs.1.29±0.11,P值均<0.001）;两组患者全髋及股骨颈骨量无显著差异。依据TBS结果:34例骨密度正常的MHPT患者中15例（44.1%）存在骨微结构受损,6例（17.6%）为骨微结构部分受损;45例骨密度正常的SHPT患者中6例（13.3%）骨微结构受损,6例（13.3%）骨微结构部分受损。结论本研究在大样本量连续纳入的中国PHPT队列中明确遗传性PHPT所占比例为18.8%,其中临床诊断62例遗传性PHPT（15.7%）,通过T-NGS在无遗传性PHPT临床表现的患者中发现12例（3.0%）携带致病性/可疑致病性变异者。阳性家族史、起病年龄小于40岁、多腺体受累均是遗传性PHPT的相关因素,建议有遗传性PHPT相关因素的患者同时进行综合征性PHPT临床筛查及T-NGS基因筛查,如有必要则进一步行MLPA筛查。本研究GCM2功能获得性变异均位于CCID内,研究纳入的PHPT患者中变异频率为0.8%,其病理类型结果支持携带激活性GCM2变异的病例中存在更高的恶性趋势。本研究队列中MEN1基因的变异检出率为85.8%,未观察到热点变异区域,基因筛查阴性患者就诊年龄偏大,但其余临床特征与基因筛查阳性者无显著差异。与SHPT患者相比,MHPT患者就诊年龄更小、泌尿系受累比例较高、TBS提示的松质骨骨微结构受损更为严重,但血钙及PTH无明显差异,甲状旁腺增生及多腺体受累比例较高。