目的人呼吸道合胞病毒(Human Respiratory Syncytial Virus,RSV)广泛分布于世界各地,是导致婴幼儿严重下呼吸道感染的最重要的病毒病原。目前尚无特异性防治方法,世界卫生组织将发展RSV疫苗列为最优先发展的疫苗项目之一。RSV的11种蛋白中,RSV的基质蛋白(matrix protein,M)是位于病毒包膜内侧的结构蛋白,在RSV病毒形态发生上具有重要作用,同时对宿主细胞的转录具有抑制作用。为进一步开展M蛋白的功能研究及寻求RSV疫苗研制的新方法,我们克隆了RSV M基因并完成了可表达RSV M蛋白的非复制型重组腺病毒的构建及鉴定。方法根据编码M蛋白的基因序列设计引物,通过RT-PCR从感染RSV的HEp-2细胞中扩增获得M蛋白基因,克隆到pGEM-T Easy载体中,序列测定正确后,将其亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,并进行酶切鉴定,脂质体法转染COS-7细胞,应用Western blotting方法分析M基因表达情况。限制性内切酶从pT/M中切下目的基因M,亚克隆至腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV,获得重组穿梭质粒pSC/M。酶切鉴定后,PmeⅠ线性化pSC/M,利用电穿孔法转化技术,把线性pSC/M转入含有pAdEasy-1的大肠杆菌E.coli BJ5183中进行同源重组,获得重组腺病毒质粒pFGAd/RSVM。酶切鉴定后,以PacⅠ酶切pFGAd/RSVM,脂质体法转染293细胞。待出现典型的细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)后,取细胞裂解液,以Western blotting鉴定目的基因表达。结果重组表达载体pcDNA3.1(+)/M的限制性内切酶分析结果与预期一致,基因序列分析显示RSV M基因没有发生无义突变。转染COS-7细胞后,Western blotting分析观察到M蛋白特异性的表达条带。重组穿梭质粒pSC/M和重组腺病毒质粒pFGAd/RSVM酶切鉴定正确。pFGAd/RSVM以PacⅠ酶切后,用脂质体法转染293细胞,观察到细胞出现CPE,用Western blotting分析,检测到M基因的表达。结论成功克隆A亚型RSV Long株M基因,并在真核细胞中获得表达。获得一株可表达A亚型RSV M蛋白的非复制型重组腺病毒FGAd/RSVM,可用于体内研究观察其免疫效果及免疫保护作用。