细胞周期调控在生物细胞中起着十分重要的作用,它调节着细胞的生长和分化。如果细胞周期调控出错会导致许多严重的后果,从而最终引发癌症。例如：在有丝分裂过程中细胞周期错误会引起基因组的不稳定或者染色体分离的异常。而有丝分裂过程受到许多蛋白激酶的调控,这些激酶的分子机制及信号传导通路有待被研究。因此,研究有丝分裂过程中起调控作用的蛋白激酶的分子机制有十分重要的意义,而且有助于进一步了解有丝分裂激酶在癌症中的作用。在有丝分裂过程中起调节作用的一种激酶叫TTK/Mpsl。它由MPS1(MonoPolar Spindle 1)基因编码,是一种重要的具有双重专一性的蛋白激酶,该酶对于肽链中的丝氨酸,苏氨酸以及酪氨酸残基具有专一性的磷酸化作用。该酶在真核生物的进化上十分保守。最近,蛋白激酶TTK已经被认为是生物基因稳定性的关键调节因子,因为它调节着许多细胞有丝分裂的重要步骤。例如：TTK不仅是纺锤体检验点的重要组成成分,而且能够修正错误的染色体排列。其激酶活性是检验点信号传导所必需的,他在有丝分裂中能够确保染色体的正常分离。在细胞周期中,TTK活性的丧失会导致减数分裂错误,出现非整倍体,这通常会导致癌症的产生,因为不正常的细胞分裂是癌细胞的一个显著特点。研究表明Mps1可以作为一种治疗癌症的新手段,然而这种治疗方法的成功运用,需要对蛋白激酶TTK的活性有更加深入的研究。本文主要的工作内容及结果如下：1.利用病毒表达体系从昆虫High5细胞中纯化得到TTK蛋白激酶。为了研究TTK激酶活性的动力学机制和酶学特征,本论文首先利用病毒表达体系在昆虫high5细胞中对TTK进行了有效地表达与纯化。这就克服了从E.coli中纯化的TTK,由于缺少必要的后翻译修饰,酶活性低的缺点。由于TTK比较容易降解,在构建载体时,分别在TTK的N末端加了GST-tag和在C末端加了His-tag。因此可以采用两步连续纯化的方法,得到均一的全长TTK。第一步,先用GST纯化,并用3C蛋白酶在柱切割以去除GST标签,然后第二步用Ni+柱进行his纯化,接着用thrombin蛋白酶切除His标签,最后纯化得到有活性的全长TTK蛋白激酶用于酶的动力学研究。为了研究D domain在TTKA蛋白激酶磷酸化活性中的作用,同时构建了去除D domain的突变体(TTK-d),并得到分离纯化。2.对Hela细胞中内源TTK进行定量,结果表明TTK的蛋白水平受细胞周期的调控。然后,为了证实TTK的蛋白水平是否受细胞周期进程的调控以及它是否在中心体复制过程中起重要作用,观测了有丝分裂的Hela细胞在整个细胞周期中的TTK蛋白水平的变化,并测定了在不同细胞周期进程中内源TTK的浓度。结果显示,TTK的蛋白水平在有丝分裂间期很低,但是在有丝分裂期也就是纺锤体检验点的活跃期其蛋白水平会增加。实验结果显示在正常的细胞周期过程中,G1/S期时细胞内的TTK浓度瞬时增加,在G2/M期达到最大值,然后在G1期又回到最低的初始水平以进入下一个细胞周期。TTK的这种变化趋势与另外两种调控有丝分裂的关键蛋白-CyclinB和Cdk的变化趋势是相似的。这些结果说明TTK水平受细胞周期的调控,另外,TTK蛋白水平的增加也与中心体复制的时间相一致,因此,该实验结果可以作为中心体复制需要TTK活性的一个新证据。3.激酶实验表明TTK自身磷酸化的分子机制是分子间相互作用,而且TTK的自身磷酸化能够增强其对底物的磷酸化。本论文还对TTK的自身磷酸化的分子机制,即该酶的自身磷酸化是分子内还是分子间的相互作用进行了研究。结果表明TTK的自身磷酸化的速率取决于TTK的浓度,它随着TTK蛋白浓度的增加而增加,这一结果证明了TTKA的自身磷酸化的机制是酶分子之间的一种作用,因为如果是分子内的作用,自身磷酸化的速率将不会随着酶分子浓度的变化而变化。此外,本论文对该酶的自身磷酸化作用和底物磷酸化作用之间的关系进行了研究。将已经先自身磷酸化的TTK和未自身磷酸化的TTK分别作用于底物TTKA,实验结果表明TTK的自身磷酸化作用会增强其对底物的磷酸化作用。这就使得其催化的反应速率曲线由Lag变成了直线,这也正是自身磷酸化是分子间作用的蛋白激酶的普遍现象。4.动力学研究表明TTK蛋白激酶的催化机制是序列反应。为了更深入地阐述TTK磷酸化活性的催化机制,用放射性同位素活性测定的方法,测定了TTK对底物磷酸化作用的动力学参数。并用双底物试验测定了TTK的稳态动力学参数。通过不同的ATP浓度和不同的底物TTKA的双底物试验,测得TTK对ATP和TTKA两种底物的Km值分别是54uM和74uM,经用MATLAB软件对多组试验数据的非线性拟合分析,结果表明直线都相交于一点,这说明TTK的酶学机制是三重复合物机制,而且在两个底物之间有消极的相互作用。5.对突变体(TTK-d)的研究表明TTK羧基末端的D domain在酶对底物的磷酸化过程中起促进作用。本论文研究了TTK羧基末端的D domain (aa 792-853)在酶的底物磷酸化中的作用,首先构建了敲除D domain的TTK突变体(TTK-d),并用与野生型TTK相同的方法在昆虫High5细胞中过量表达,纯化。纯化得到的TTK-d突变体与野生型TTK相比,突变体的自身磷酸化活性没有显著变化但对底物的磷酸化活性降低3-5倍。这就表明D domain对酶的自身磷酸化没有太大影响,但对于酶的底物磷酸化有一定作用。最后,本论文也对TTK-d进行了双底物稳态动力学参数测定与分析。TTK-d的ATP的Km和TTK-wt基本相当,但TTK-d对另一底物TTKA的Km(130μM)值比wt的高,说明TTK-wt对TTKA有更高的结合。由此推测,D domain中的氨基酸残基可能与catalytic domain的氨基酸残基相互作用以有利于酶与底物TTKA的结合,从而提高酶的活性。总之,本论文首次对TTK激酶活性的动力学机制进行了研究,通过双底物动力学分析阐明了TTK是序列反应催化机制并且推测了羧基末端的D domain在TTK激酶活性中的作用。该研究结果为人类蛋白激酶家族的研究打下了基础,为将蛋白激酶TTK用于癌症治疗提供了理论依据。