植物的衰老过程是植物发育的重要阶段,对植物顺利完成生命周期有着重大的意义,植物叶片的提前衰老往往影响作物的产量。由于植物自身的不可移动性,使其在生长发育过程中,不可避免的遭受到各种生物胁迫和非生物胁迫,这些胁迫会引发植物叶片的早衰甚至死亡,严重制约着农业产量,因此对调控植物衰老过程相关机理的研究,在调节植物生长发育和提高作物产量方面有着重要的理论和实践意义。促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号途径是生物体内保守的信号传导方式,其通过传导细胞内部和外部的信号来调节细胞的反应,在植物生长发育和对胁迫响应的过程中发挥着重要的作用。本研究中证明拟南芥基因MKKK19不仅参与调控植物的正常生长发育衰老过程,也参与调控逆境下的植物衰老进程。与野生型WT（wild type）相比,由T-DNA插入造成拟南芥MKKK19弱表达的突变体表现出株型较大、且叶片衰老明显延迟的表型,而过量表达MKKK19的植株的株型较小、叶片提前进入衰老时期;将MKKK19自身启动子驱动其编码序列的载体转化到突变体中构建的回补植株能恢复MKKK19突变引起的株型较大和衰老延迟表型。实时荧光定量PCR分析发现,在相同发育时期,与野生型植株相比,衰老相关基因SAGs（SAG12、SAG113、At NAP和WRKY6）在突变体中的表达量下降,超表达植株中SAGs的表达量明显上升,在回补材料中SAGs的表达也恢复到与野生型相当的水平。因此,MKKK19参与调控植物生长发育和叶片衰老的进程,且MKKK19的表达量影响SAGs的表达量。利用激光共聚焦显微镜观察MKKK19-GFP融合蛋白的荧光信号,发现MKKK19在细胞膜、细胞质和细胞核中均有表达。组织化学染色分析与实时荧光定量PCR分析表明,MKKK19在拟南芥的根、茎、花和叶片中均有表达,在莲座叶中的表达量最高。MKKK19的表达模式与SAG12类似,表达量随叶龄的升高而增加,在幼叶中几乎不表达,而在成熟和衰老的叶片中特异性表达,因此MKKK19参与调控年龄介导的植物叶片衰老过程。同时一些诱导衰老的胁迫相关因素,如乙烯、茉莉酸、脱落酸、水杨酸、过氧化氢和黑暗条件均能促进MKKK19的转录,因此推测MKKK19可能还参与调控逆境胁迫下的衰老过程。体外原核表达的MKKK19具有自磷酸化活性,并能磷酸化通用底物髓鞘碱性蛋白（Myelin Basic Protein,MBP）;同时通过对转基因拟南芥中纯化的MKKK19活性的分析,发现在幼嫩叶片中的MKKK19的激酶活性较弱,成熟莲座叶中MKKK19的激酶活性较幼嫩叶片中的稍高,而成熟且初步衰老的叶片中MKKK19的激酶活性最高。因此,MKKK19的激酶活性与叶片衰老程度相关。此外,将MKKK19中ATP结合位点的关键氨基酸进行突变,表达并纯化MKKK19K37M,体外蛋白激酶活性检测实验发现,MKKK19K37M激酶丧失了自磷酸化和磷酸化底物的活性;将突变型的MKKK19K37M用MKKK19自身启动子驱动并在突变体植株中表达,所获得的转基因回补植株的株型大小和叶片衰老进程与突变体相似;将突变型MKKK19K37M用35S超强启动子驱动转入野生型植株中,所获的过量表达转基因植株表现出与野生型植株类似的株型和叶片衰老进程,而不是超表达野生型MKKK19所表现的株型较小、叶片提前衰老表型。这些结果表明,MKKK19的激酶活性对于其调控衰老进程有着至关重要的作用。通过分析10个MKKs在不同衰老程度叶片中的表达模式,来鉴定MKKK19下游的MKKs,结果显示,MKK1、MKK3、MKK5和MKK9的转录水平受衰老进程的调控,表现出随着叶片成熟到衰老进程的推进,其表达量逐渐上升。另外,在10种MKKs过量表达的转基因植株中,35S:MKK1、35S:MKK3、35S:MKK5、35S:MKK9的植株表现出明显的提早衰老表型。以酵母双杂交系统和双分子荧光互补分析筛选与MKKK19相互作用的MKKs,发现MKK3、MKK4、MKK5、MKK6、MKK9、MKK10能与MKKK19相互作用。Co-IP实验结果进一步证实MKKK19能与MKK3、MKK5和MKK9相互作用。这些结果表明,MKK3、MKK5和MKK9可能处于MKKK19下游,受MKKK19磷酸化激活,并参与调控衰老进程。此外体外磷酸化实验发现MKKK19能够磷酸化MKK5。表型分析发现,与野生型相比,MKK3、MKK5和MKK9的突变体表现出与MKKK19突变体类似的表型,即在正常生长条件下衰老延迟,株型较大;而过量表达MKK3、MKK5和MKK9后,都表现出衰老提前,株型显著变小的特征。将MKKK19分别在MKK3、MKK5和MKK9的突变体中过量表达,观察这些转基因植株发现它们表现出与野生型植株类似的衰老进程。即MKK3、MKK5和MKK9的突变能在一定程度恢复MKKK19过量表达植株表现的早衰表型,MKK3、MKK5和MKK9是处于MKKK19下游的组分,参与调控拟南芥叶片的发育和衰老进程,而且MKK3、MKK5和MKK9之间存在着功能的冗余性,因为MKK3、MKK5和MKK9的突变只能部分恢复过量表达MKKK19引起的叶片早衰表型。MPK6是MKK3、MKK5和MKK9的共同底物,参与调控植物不同的生长发育过程。衰老可以促进拟南芥MPK6的表达,并且MPK6的激酶活性随衰老进程的推进而增强。表型分析发现,MPK6突变体表现出明显的衰老延迟表型,与MKKK19、MKK3、MKK5和MKK9突变体的表型类似;过量表达MPK6的材料表现出叶片早衰。而且,MPK6的突变能在一定程度恢复过量表达MKKK19、MKK3、MKK5和MKK9植株的叶片早衰表型。这些数据表明,MPK6参与调控MKKK19-MKK3/5/9介导的衰老过程,但可能还存在其他MPKs参与MKKK19-MKK3/5/9调控的植物叶片衰老过程。综上所述,本研究中鉴定到了一条完整的MAPK级联信号途径:MKKK19-MKK3/5/9-MPK6,并初步阐明了该MAPK级联途径在调控植物的株型和自然衰老过程中起作用,且可能参与各种胁迫诱导的植物叶片衰老过程。