水稻是一种起源于热带和亚热带地区的冷敏感作物。随着水稻种植区域的不断扩大,低温成为限制水稻种植的主要影响因素之一。水稻在全生育期都容易遭遇低温冷害,其中孕穗开花期时的冷害会对其产量造成不可逆的损失。因此,克隆水稻孕穗期耐冷基因,挖掘优异的基因资源对于水稻耐冷性的改良,保障我国晚季稻及其寒地水稻种植区域的稳产性具有重要意义。实验室前期研究工作中,利用孕穗期耐冷粳稻昆明小白谷（KMXBG）和冷敏感粳稻“Towada”构建了一系列近等基因系。本研究利用一个耐冷近等基因系ZL31在10号染色体上精细定位了两个QTL,qCTB10-1和qCTB10-2。同时利用另外一个近等基因系NIL1913在4号染色上克隆了一个孕穗期耐冷基因CTB4b,并分析了其孕穗期耐冷调控机理及起源演化过程。本研究的主要结果如下:1.孕穗期耐冷QTL qCTB10-1和qCTB10-2的精细定位利用耐冷近等基因系ZL31和Towada构建BC7F2定位群体,根据初步定位的结果,发现在10号染色体上包含两个QTL,分别命名为qCTB10-1和qCTB10-2。为了精细定位两个QTL,本研究利用只包含单个QTL片段的单株自交扩大群体,将两个QTL分开,分别进行定位。最终将qCTB10-1定位到10号染色体17 kb的区间。同时,本研究利用另外一个群体将qCTB10-2定位到10号染色体132.5 kb的区间上,该区间范围内有17个ORFs,其中只有5个ORFs编码蛋白,而这5个基因中有4个受到冷诱导的表达,因此推断这4个基因可能与孕穗期耐冷性相关。2.CTB4b的克隆及功能机理分析利用孕穗期耐冷的近等基因系NIL1913和Towada构建定位群体,将目标QTL定位到4号染色体56.8 kb的区间,该区间包含有4个ORFs,测序比对分析发现有两个ORFs存在差异,其中一个为已克隆的CTB4a,将另一个ORF命名为CTB4b。CTB4b在NIL1913和Towada中只在编码区存在两个SNP的变异,其中只有一个SNP引起氨基酸的变化。通过对不同转基因株系多年多点的耐冷性评价,证明CTB4b是正向调控水稻孕穗期耐冷性。表达模式分析表明,CTB4b明显受到冷诱导表达并且在亲本之间没有差异。另外qRT-PCR、GUS染色和原位杂交分析表明该基因在穗中高量表达。CTB4b编码一个在植物中保守的UDPG甾醇葡糖基转运蛋白,蛋白结构域分析发现,亲本间差异的SNP位于蛋白的保守结构域上。体外酶活的结果证明CTB4b可以促进UDP和甾醇糖苷的生成。同时体内生成物的检测证明CTB4b影响冷胁迫下水稻穗部甾醇糖苷和乙酰化甾醇糖苷的积累。甾醇糖苷类物质对细胞膜的渗透性以及花粉外壁的形成具有重要作用,结合电解质渗透性测定、花粉粒及花粉外壁观察结果表明在低温胁迫下CTB4b可能是通过调控甾醇糖苷类物质的生成,进而影响细胞膜的渗透性及花粉壁的结构,最终提高水稻孕穗期耐冷性。3.CTB4b和CTB4a的起源进化分析利用实验室118份水稻种质材料孕穗期耐冷的表型数据和重测序的基因型数据对CTB4b进行单倍型分析。结果表明包含有CTB4b功能SNP的水稻种质表现出较强的孕穗期的耐冷性。进一步结合系统发生树和最小生成树的分析表明CTB4b耐冷单倍型来源于野生稻,通过驯化选择,该单倍型仅仅在高海拔高纬度冷凉地区的温带粳稻中出现。核酸多样性分析、中性测验及MLHKA分析结果表明该基因在温带粳稻驯化中受到强烈的人工选择。进一步联合已克隆的CTB4a基因的单倍型分析,发现包含两个基因功能位点的材料具有更强的孕穗期耐冷性。同样这些材料也是分布在高纬度的东北地区和高海拔的云南丽江的高原水稻种植区。CTB4a-CTB4b联合核酸多样性、中性测验及MLHKA分析结果证明这两个基因在温带粳稻驯化的过程中受到人工选择。在温带粳稻初期的驯化中,为适应高纬度高海拔冷凉环境,CTB4b从野生稻中选择保留在温带粳稻中,使其具有一定的耐冷性,进一步在这些地区强冷选择压的作用下,CTB4a在包含有CTB4b的温带粳稻中产生新的变异,由此选择出包含两个耐冷基因的温带粳稻,并具有更强的耐冷性。