研究背景子宫颈癌是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一,在女性恶性肿瘤中,发病率仅次于乳腺癌。子宫颈癌严重威胁着女性的健康。全球范围内,每年约有50万新发病例,约有20多万女性死于子宫颈癌,大约80%发生在发展中国家,可能与发展中国家子宫颈癌的筛查与治疗条件有关。我国每年新发病例约13万,且发病年龄有年轻化的趋势。90%以上人宫颈癌的发病原因与高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)持续感染有关,主要为HPV16、18亚型。随着宫颈细胞学筛查的普遍推广应用,宫颈癌前病变及宫颈癌的早期诊断及治疗得到改善,子宫颈癌的发病率和死亡率已有所下降。但其发病机制至今仍并不完全清楚。近年来随着分子生物学的发展,已经证明由于遗传学及表观遗传学(epigenetic)的改变使抑癌基因的失活和癌基因的激活在宫颈癌的发生发展中起着重要的作用。表观遗传学定义为未涉及DNA序列的改变,但可通过细胞的有丝分裂而遗传的基因功能的改变。表观遗传异常主要包括DNA甲基化异常、组蛋白修饰改变、基因组印记缺失及非编码RNA异常调节等。其中目前研究最多的是DNA的甲基化及组蛋白乙酰化。越来越多的证据表明,抑癌基因启动子的异常甲基化、组蛋白异常修饰异常等表观遗传学的改变与宫颈癌发生发展关系密切。丙戊酸钠(valproic acid, VPA)是一种传统的抗癫痫药物,同时能够抑制组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase, HDAC)的活性,使组蛋白去乙酰化减少,在多种肿瘤中有抑制细胞增殖、促进凋亡和分化的作用。全反式维甲酸(all-trans retinoic acid, ATRA)是维生素A的生物活性代谢产物,与其受体RARβ2(retinoic acid receptor β2,)结合,具有促进上皮细胞分化成熟的作用,其已作为一种诱导分化剂用于临床肿瘤治疗。研究表明,RARβ2在包括子宫颈癌在内的许多肿瘤中表达减少,其表达调控与组蛋白的甲基化及去乙酰化密切相关。我们前期实验结果证实,VPA联合ATRA可以提高宫颈癌细胞株组蛋白乙酰化程度,通过表观遗传途径重启/上调RARβ2的表达。由此,我们推测ATRA即可通过与RARβ2结合,启动上皮细胞正常分化成熟途径,上调E-cadherin及上皮细胞分化指标Filaggrin、 Involucrin和Loricrin的表达,进而发挥其促进分化和抗肿瘤作用。三维细胞培养技术(Three-dimensional cell culture,TDCC)是指将细胞培养于具有三维结构的载体,使细胞在载体的三维空间结构中迁移、生长,从而形成细胞-载体三维复合物。TDCC既能最大程度的模拟体内环境,又能展现细胞培养的直观性及条件可控性的优势,在对药物毒理和药效的评估试验中具有重要应用。TDCC在体外构建与体内相近的细胞发育结构系统,为针对肿瘤微环境的药物设计提供了很好的模型。本实验将构建子宫颈癌细胞的三维细胞培养模型,探讨VPA联合ATRA对三维细胞培养模型中子宫颈癌细胞生长状况及诱导分化作用,从而为寻求新的子宫颈癌治疗方法提供参考。目的探讨VPA联合ATRA对三维细胞培养模型中子宫颈癌细胞的诱导分化作用。方法HeLa和SiHa细胞株接种于培养支架,构建宫颈癌细胞三维培养模型；实验分为三组,实验组采用VPA (3mmol/L)与ATRA (1μmol/L)联合处理,拮抗剂组在VPA和ATRA联合作用的同时加入PI3K抑制剂LY-294002处理,对照组仅加入等量DMSO;2周后,收获支架,石蜡包埋、切片,采用免疫荧光检测维甲酸受体RARβ2、E-cadherin及上皮细胞分化指标FilaggrinInvolucrin和Loricrin的表达；利用免疫荧光双标技术检测RARβ2/p-AKT、E-cadherin/p-AKT与p-Akt/Involucrin表达的时空关系,分析PI3K/Akt通路的调控作用。结果(1)VPA联合ATRA作用于三维培养细胞模型,肿瘤形态学发生改变,SiHa与HeLa细胞复层数与对照组比较明显减少；(2)与对照组比较,VPA联合ATRA上调三维培养模型中HeLa和SiHa细胞RARβ2及E-cadherin的表达(p<0.01),进而诱导上皮细胞分化标记Filaggrin、Involucrin和Loricrin的表达(p<0.05)；(3)加入LY-294002后RARβ2和E-cadherin的表达无明显变化,但显著抑制Akt的磷酸化p<0.01),分化指标的表达显著降低(p<0.01)。结论VPA联合ATRA可诱导三维培养模型中子宫颈癌细胞的分化；上调RARβ2及E-cadherin的表达,通过PI3K/Akt信号通路发挥作用是其可能的作用机制。