体细胞核移植技术的成功为哺乳动物核移植历史开辟了新纪元，同时也为转基因动物的制备开辟了一个新的方向。目前，体细胞核移植技术已经成为制备转基因动物的理想途径，但是该技术还存在很多问题，总体效率还不高，极大地制约了其在转基因领域中的应用。转基因体细胞核移植是一个复杂、系统的技术体系，主要包括了供体细胞培养、外源基因转入和筛选、卵母细胞采集与去核、核移植操作和胚胎移植等众多环节，每个环节都会影响到转基因核移植动物的生产效率。因此，本文从供体细胞、受体细胞、核移植操作和胚胎移植等几个关键技术环节对转人乳铁蛋白(Human lactoferrin, hLF)基因核移植奶山羊的生产进行系统研究，探讨提高转hLF基因核移植奶山羊生产效率的方法。本文的主要研究结果如下:　　 1.供体细胞　　 影响转基因体细胞核移植效率的因素很多，选择合适的供核细胞是完成核重编程及其以后发育的首要条件。在本研究中，三个转hLF基因细胞系分别来自三只3月龄的雌性萨能奶山羊的耳组织（分别命名为1号、2号、3号）。首先，转hLF基因与非转基因的核移植胚胎发育能力没有显著差异，外源基因插入和药物筛选的转基因成纤维细胞可以作为核供体细胞。其次，血清饥饿和接触抑制处理的转hLF基因成纤维细胞G0/G1期比例和凋亡率显著高于对照组，但这三种细胞得到的核移植胚胎的发育能力并没有显著差异，这表明供体细胞G0/G1比例和凋亡率并不是影响附植前转hLF基因核移植胚胎的发育能力的首要条件。而血清饥饿和接触抑制处理的细胞作为核供体生产的转hLF基因核移植胚胎植入受体山羊后发现，血清饥饿组的产羔率要高于接触抑制组（分别为18，0％），表明血清饥饿处理有利于转hLF基因克隆奶山羊的生产。分别用三个转基因细胞系作为供核细胞时，1号奶山羊转hLF基因细胞系的生产效率要显著高于2号和3号，表明遗传背景可能也是影响转基因体细胞核移植的一个重要因素。　　 2.受体细胞　　 卵母细胞是体细胞核移植技术中最普遍使用的受体细胞，它主要为供体核去分化，恢复全能性提供环境，对重构胚的发育有着重要影响。在山羊卵母细胞采集过程中，用切剖法和抽吸法得到的可用卵母细胞的数量和成熟率都没有显著差异(P＞0.05)，这两种方法都适用于山羊卵母细胞的采集。山羊卵母细胞体外成熟培养中，培养液中添加10μg/mL的FSH和LH是最合适的，而卵母细胞体外成熟培养19～23h，成熟率最高。在体细胞核移植试验中，体内成熟的卵母细胞生产转hLF基因核移植胚胎的卵裂率要显著高于体外成熟组(P＜0.05)，表明体内成熟的卵母细胞发育潜能更好。而转hLF基因核移植胚胎植入受体羊后，体内成熟卵母细胞的怀孕率和产羔率与体外成熟组差异不显著(P＞0.05)，但体外成熟组的怀孕羊流产较多，表明体内成熟的卵母细胞更适宜作为转基因体细胞核移植的受体胞质。　　 3.核移植操作　　 主要对体细胞核移植的显微操作、电融合、胚胎培养等技术环节进行研究，并通过胚胎筛选，生产转hLF基因克隆奶山羊。对于成熟19～20 h的卵母细胞，盲吸去核法和荧光辅助去核法的去核效率没有显著差异(P＞0.05)，但盲吸去核法的操作速度快于荧光辅助去核法，随着卵母细胞成熟时间的延长，盲吸去核法的去核成功率显著降低(P＜0.05)。这表明，成熟19～20 h的卵母细胞去核首选盲吸去核法，而成熟23～24 h的卵母细胞去核宜采用荧光辅助去核法。重构胚融合时，1.2和1.4KV/cm电场强度下融合率最高，但是1.4 KV/cm融合时重构胚死亡数较多，在转hLF基因重构胚融合时，应选择1.2 KV/cm的电场强度。比较不同胚胎培养体系发现，KSOM-TCM199中核移植胚胎囊胚发育率显著高于TCM199(P＜0.05)，表明KSOM适合作为卵裂阶段转hLF核移植胚胎的培养液。将卵裂阶段（融合后48 h）的转hLF基因核移植胚胎分类培养发现，3-4细胞和5-8细胞阶段的转hLF基因核移植胚胎的囊胚率要显著高于2-和＞8-细胞阶段胚胎(P＜0.05)，Hoechst33342染色可以发现，＞8-细胞阶段的胚胎中，胚胎碎片较多。通过对转hLF核移植胚胎进行筛选，剔除掉2-和＞8细胞阶段的胚胎，将138枚胚胎植入到15只受体羊体内，得到本实验室第一只转hLF基因克隆奶山羊。　　 4.维生素E和TSA对转hLF基因核移植胚胎发育能力的影响　　 本试验研究了维生素E对转hLF基因成纤维细胞凋亡及基因表达的影响，同时还分析了维生素E和TSA对转基因克隆胚胎发育能力的影响，为进一步研究维生素E和TSA对转基因克隆奶山羊生产效率的影响打下基础。用含100μmol/L维生素E的DMEM培养转hLF基因的奶山羊成纤维细胞发现，其凋亡率要显著低于对照组(P＜0.05)。然后又通过荧光定量PCR检测了维生素E对转hLF基因成纤维细胞基因表达模式的影响，检测的基因有印记基因(IGF2，IGF2R)、凋亡相关基因(Bax)、应激相关基因(Hsp70.1)。其中IGF2基因的表达水平显著高于对照组（P＜0.05）。用含100μmol/L维生素E的培养液培养转hLF基因的供体细胞和重构胚发现，处理组的囊胚发育能力与对照组差异不显著(P＞0.05)。本试验还比较了不同浓度的TSA对转hLF基因核移植胚胎发育能力的影响，其中5nmol/L和20 nmol/L的TSA能显著提高转hLF基因克隆胚胎的囊胚发育率(P＜0.05)。　　 5.胚胎移植和克隆奶山羊的甲基化分析　　 将转hLF基因的核移植胚胎植入受体山羊体内，观察转hLF基因克隆奶山羊的生产效率，并对一只1月龄转hLF基因克隆奶山羊的H19基因甲基化状态进行研究。1细胞、2-8细胞和囊胚阶段的转hLF基因的核移植胚胎分别植入到同期受体羊体内发现，1细胞和2-8细胞阶段的胚胎怀孕率和产羔率均高于囊胚期，这表明转hLF基因的核移植胚胎最好在1-8细胞阶段植入到受体羊体内。通过比较不同月份的生产效率发现，产羔率以11月份和2月份最高（分别为13％和10％），其次是12月份和3月份（同为4％），1月份的转基因奶山羊生产效率最低，产羔率为0，这表明气候环境条件（温度和光照）对转hLF基因克隆奶山羊的生产影响很大。进一步比较胚胎植入数量对受体羊的影响，结果发现流产的受体羊植入的胚胎数都在10枚以上（含10枚），而植入10枚以下的受体羊没有出现流产情况，但是10枚以下的受体羊只有11月份有怀孕的，其他月份均没有。因此，为了提高转hLF基因克隆奶山羊的生产效率，植入10～18枚比较合适。本试验还对一只1月龄的转hLF基因克隆奶山羊不同组织的H19基因甲基化状态进行检测，其肺脏组织H19基因的甲基化程度要显著低于普通羊(P＜0.05)，表明这只转hLF基因克隆奶山羊肺脏组织DNA甲基化异常可能是致其死亡的主要原因。