细胞内的一些信号转导分子对调节细胞的生理功能起着重要作用。研究这些信号转导分子在细胞内的浓度变化、位置迁移等问题对揭示其转导过程中的规律和机制以及针对相应疾病进行药物的开发有着十分重要的意义。近年来,新型纳米材料的出现以及功能核酸的发展,为构建响应各种目标物的生物荧光探针并将其应用于活细胞成像提供了新的设计思路和平台。本论文基于功能核酸与目标物之间的相互作用,以及纳米材料的光学性质,结合对细胞内重要信号转导分子的细胞成像研究热点,开发一些多功能的复合型生物荧光探针,并重点探讨探针的构建方法以及检测机理等问题。本论文中构建的生物荧光探针能灵敏且特异性地检测对应的信号转导分子,同时实现对这些信号转导分子的非侵入式、·原位的实时活细胞成像分析。具体的工作内容如下:三磷酸腺苷(ATP),不仅是生物体的能源物质,同时也是神经细胞间传递信息的信号分子。它在星形胶质细胞间作为“胶质递质”的释放过程参与了神经系统的生理和病理过程。因此监测ATP的释放对相关疾病的诊断及预后有着重要意义。在第2章中,基于核酸适配体与ATP结合前后的构型变化,构建一种锚定在细胞膜上的功能核酸生物荧光探针,用于检测细胞ATP的释放过程。分别在核酸适配体的5′端和3′端标记Cy3和生物素分子,并将其与另一条3′端修饰了Cy5的部分互补的ss DNA杂交,得到一条带有荧光能量共振转移(FRET)信号的杂交链。标记了生物素的磷脂能在低温条件下自发的插入到细胞膜中,再利用生物素-链霉亲和素(SA)交联的方法将杂交链修饰在磷脂上,从而实现了将功能核酸生物荧光探针锚定在细胞膜上。当细胞坏死时,细胞内的ATP释放出来会流经细胞膜,并与锚定在细胞膜上的生物荧光探针发生相互作用,使得核酸适配体的构象发生变化且FRET效应被阻断,从而探针的光学信号发生改变,实现实时可视化检测ATP的释放过程。该方法操作简单,分析成本低廉且选择性良好,有望用于临床研究。高活性氧物质(h ROS)是一类重要的信号分子,细胞内过量积累的h ROS诱导的氧化损伤与许多疾病相关。在第3章中,开创性的利用首次发现的谷胱甘肽保护的金纳米簇(Au NCs)的荧光能选择性的被h ROS猝灭的机理,特异性地检测了均相溶液中的h ROS,且针对?OH、HCl O、ONOO-这三种h ROS的检测限分别为0.03μM,0.5μM,0.2μM。为了将这种“猝灭型”探针应用于细胞成像研究中,在第4章中,构建了一种复合型荧光纳米探针,用于响应细胞在受到外界刺激时、自发产生h ROS的活细胞成像方法。在掺杂了染料(其激发和发射峰分别在405nm和435nm处)的硅纳米颗粒表面修饰上链霉亲和素,用相同的方法将Au NCs修饰上带生物素的穿膜肽(CPP)。利用生物素-链霉亲和素交联的方法将两种纳米材料复合在一起,形成了具有单激发双发射性质的复合纳米荧光探针。由于穿膜肽的作用使得该探针可以自发的进入细胞。当该探针遇到h ROS时,Au NCs在565nm处的荧光强度降低而作为内参的硅纳米颗粒在435nm处的荧光强度不变。该方法选择性好,响应速度快,尤其是可以通过处于435nm和565nm处的两个发射带的比值来提高荧光方法的精确度,从而避免由于探针未被细胞充分吞噬而带来的假阳性现象的产生。此外,与传统的基于有机荧光染料探针相比,该探针生物相容性好,抗光漂白能力强,非常适合用于细胞内h ROS的实时成像分析。细胞色素C是决定细胞凋亡的重要信号。细胞色素C的释放是引起细胞不可逆凋亡的关键点。在第5章中,基于标记了染料的核酸适配体易于吸附在氧化石墨烯的表面且荧光被猝灭的基本原理,发展一种PEG化的氧化石墨烯-核酸适配体响应细胞色素C的生物荧光纳米复合物探针。利用化学交联剂EDC/suflo-NHS,在氧化石墨烯的表面共价交联双氨基、分子量为1500的PEG分子,并在PEG分子的另一端氨基上修饰叶酸分子,然后再吸附识别细胞色素C的核酸适配体。与传统的氧化石墨烯探针相比,该纳米复合物探针的水溶性更好,灵敏度更高,检测细胞色素C的线性范围更宽。随后,在第6章中将该探针用于细胞凋亡的研究,首次实现了直接可视化示踪细胞色素C从线粒体释放到细胞质的荧光激活式成像过程。在细胞未凋亡时,细胞色素C位于线粒体的内外膜的间隙中,而此时的探针通过叶酸的靶向作用进入到细胞质中,由于两者无法接触所以没有荧光信号;当细胞在药物刺激下发生凋亡时,细胞色素C从线粒体释放到细胞质中,从而与核酸适配体结合并远离氧化石墨烯的表面,导致荧光信号的产生,实现细胞凋亡时的细胞色素C的原位检测。细胞色素C的释放是从细胞受到1μM星孢菌素(STS,一种凋亡诱导剂)刺激的15分钟之后开始的,并在25分钟后全部释放完。与利用检测细胞内Caspase家族酶的活性来反应细胞发生凋亡的传统方法相比,该方法的检测时间更短。同时该方法重现性好,使其有望成为检测细胞凋亡的商业化探针,并在细胞水平上为细胞凋亡的研究,围绕细胞色素C信号转导过程的研究以及筛选抗癌药物提供了一个可靠且实用的平台。