兔OCT4基因启动子驱动RFP表达载体的构建及验证

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OCT4转录因子在维持和调控胚胎干细胞的多能性中发挥着重要的作用。OCT4基因启动子驱动标志蛋白的表达对胚胎干细胞多能性研究和iPS的建立有重要的意义。由于绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein, GFP)在慢病毒转染过程中常用作转染标记,因此构建兔OCT4基因启动子驱动红色荧光蛋白(Red fluorescent protein, RFP)的表达,将有利于兔iPS制备的研究。本研究通过PCR方法克隆了兔的OCT4启动子(rOCT4),构建了rOCT4驱动RFP的表达载体rOCT4-RFP,经转染小鼠ES细胞验证正确后,将rOCT4-RFP转染兔成纤维细胞系获得兔rOCT4-RFP成纤维细胞。结果:经过酶切和测序验证,证明rOCT4-RFP构建成功,而且能够在小鼠ES细胞系E14中表达细胞红色荧光蛋白,而分化后的rOCT4-RFP转基因E14细胞不表达红色荧光蛋白。通过脂质体介导的基因转移、抗性筛选和PCR鉴定建立了rOCT4-RFP转基因成纤维细胞系。OCT4启动子的甲基化与干细胞的多能性有关,为将来研究OCT4启动子的甲基化与细胞的状态变化,拟建立甲基化的研究平台。本研究已获得pEGFP-C1转基因兔,pEGFP-C1是由CMV启动子启动GFP的表达,受甲基化影响体外培养的GFP兔成纤维细胞不表达绿色荧光。本研究基于对pEGFP-C1的转基因兔后代的成纤维细胞基因组CMV启动子甲基化水平的检测来验证GFP荧光表达受甲基化影响。
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