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[背景]胃癌严重危害人类健康,目前尚不明确其具体的发病机制。探索其机制可能为临床治疗胃癌提供新的思路。研究发现,microRNA-130a-5p(miR-130a-5p)与癌症的发展密切相关,并且其在癌症发展过程中所扮演的角色与癌症种类密切相关,目前尚不明确miR-130a-5p在胃癌发展过程中的作用和机制。坍塌反应调节蛋白(Collapsin response mediator proteins 4a,CRMP4a)和CRMP4b已被报道是miR-130a-5p的潜在下游靶标,并且CRMP4a和CRMP4b在调控多种生命活动中具有相反的作用,但是目前尚未有文献报道CRMP4a和CRMP4b在癌症发展过程中的作用,也尚不明确两者之间是否具有调控作用。RhoA在胃癌发展过程中扮演促癌因子的角色,并且RhoA也是CRMP4a的潜在下游靶基因。基于此,我们推测miR-130a-5p可能通过调控CRMP4a/CRMP4b/RhoA分子轴,参与胃癌的发病过程。[目的]确证miR-130a-5p可能通过调控CRMP4a/CRMP4b/RhoA分子轴参与调控胃癌发展过程的具体分子机制。[方法](1)收集2015年6月-2016年6月至昆明医科大学附属延安医院就诊的53例胃癌患者癌组织(实验组)和癌旁正常组织(对照组),其中男性患者33例,女性患者20例,35例患者年龄>55岁,18例患者年龄≤55岁。22例患者处于TNM Ⅰ-Ⅱ期(包括ⅠA、ⅠB、ⅡA、ⅡB期),31例患者处于TNM Ⅲ-Ⅳ期(包括 Ⅲ A、Ⅲ B、Ⅲ C、Ⅳ 期),采用实时荧光定量 PCR(Real-Time qPCR,RT-qPCR)检测患者肿瘤和癌旁组织内miR-130a-5p的表达水平;分别在体外培养人正常胃表皮细胞系GES-1以及人胃癌细胞系BGC823、GC9811、HGC-27、MGC-803和NCL-N87,RT-qPCR分别检测上述细胞内miR-130a-5p的表达水平。设计并构建miR-130a-5p模拟物(mimics)和抑制物(inhibitor)分别转染人胃癌细胞系BGC823,RT-qPCR确定转染效率,MTT法检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡,Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力,Western Blot检测凋亡相关蛋白(Caspase 3、Bcl-2和Bax)的表达水平。(2)收集患者癌组织(实验组)和癌旁组织(对照组),RT-qPCR和Western Blot分别检测CRMP4a和CRMP4b的mRNA和蛋白表达水平,收集培养胃癌细胞,并采用RT-qPCR和Western Blot分别检测CRMP4a和CRMP4b在胃癌细胞的异常表达情况,分析其与miR-130a-5p表达水平的关系。设计并构建CRMP4a和CRMP4b慢病毒超表达载体(pLVX-CRMP4a和pLVX-CRMP4b)和敲降载体(pLVX-sh-CRMP4a 和 pLVX-sh-CRMP4b),分别转染人胃癌细胞系 BGC823,RT-qPCR确定转染效率,MTT实验检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期,Transwell侵袭实验和克隆形成实验检测细胞侵袭能力。(3)RT-qPCR和Western Blot分别在转录和翻译水平检测RhoA在患者胃癌组织以及胃癌细胞系的表达情况。在体外培养人胃癌细胞系BGC823,分别采用CRMP4a和CRMP4b慢病毒超表达和敲降载体转染胃癌细胞,RT-qPCR和Western Blot分别在转录和翻译水平检测细胞RhoA的表达水平,并分析其与miR-130a-5p、CRMP4a和CRMP4b表达水平的相关性。MTT法检测细胞的增殖能力,Transwell侵袭实验检测细胞的侵袭能力。建立荷瘤裸鼠动物模型,在动物体内进一步验证miR-130a-5p对胃癌发生、发展的影响。[结果](1)与癌旁组织比较,miR-130a-5p在患者胃癌组织内表达水平明显升高(P<0.05)。其表达水平与患者的TNM分期相关(P<0.0001),而与患者年龄和性别无关(P>0.05)。体外细胞实验显示,miR-130a-5p在人胃癌细胞系BGC823、GC9811、HGC-27、MGC-803和NCL-N87内的表达水平明显高于人正常胃表皮细胞系GES-1(P<0.05)。进一步研究发现,miR-130a-5p能够明显促进人胃癌细胞系BGC823的增殖和侵袭(P<0.05),并抑制细胞凋亡(P<0.05)。此外,miR-130a-5p能够明显抑制促凋亡基因Caspase 3和Bax的表达(P<0.05),提高Bcl-2蛋白的表达水平(P<0.05)。(2)与癌旁组织比较,CRMP4a在胃癌组织内的表达水平明显下调(P<0.05),而CRMP4b在胃癌组织内的表达则明显上调(P<0.05),两者的表达水平呈负相关(P<0.0001,r=-0.6726)。CRMP4a和CRMP4b的在癌组织内的表达水平与患者的年龄(P=0.8543,P=0.5931)和性别(P=0.4515,P=0.4141)无明显相关性,但是CRMP4a的表达水平与TNM分期呈负相关(P<0.0001),CRMP4b的表达水平与TNM分期呈正相关(P<0.0001)。体外细胞实验证实,与GES-1细胞比较,CRMP4a在则呈低表达(P<0.05),而CRMP4b在胃癌细胞内呈高表达(P<0.05)。进一步实验证实,超表达CRMP4a或敲降CRMP4b能够明显抑制细胞增殖(P<0.05)和侵袭能力(P<0.05),并促进细胞凋亡(P<0.05)。此外,进一步实验证实miR-130a-5p能够通过下调CRMP4a的表达水平,上调CRMP4b的表达,促进细胞增殖和侵袭(P<0.05),并抑制细胞凋亡(P<0.05)。(3)RhoA在胃癌组织内的表达水平明显高于癌旁组织(P<0.05),并且RhoA mRNA的表达水平与患者的TNM分期呈正相关。此外,与人胃上皮细胞系GES-1相比,RhoA 在胃癌细胞系 BGC823、GC9811、HGC-27、MGC-803 和 NCL-N87中呈高表达,并且使用RhoA抑制剂(Rhosin)能够明显抑制胃癌细胞的增殖和侵袭能力(P<0.05)。进一步结果显示,CRMP4a能够明显抑制RhoA在BGC823细胞内的表达水平(P<0.05),CRMP4b则对RhoA在BGC823细胞内的表达水平无明显影响(P>0.05);miRNA-130-5p模拟物能够明显提高BGC823细胞系内RhoA mRNA和蛋白的表达水平(P<0.05),而同时转染CRMP4a慢病毒超表达载体则能够逆转miRNA-130a-5p模拟物对RhoA表达水平的促进作用(P<0.05)。动物实验结果显示,miR-130a-5p能够通过CRMP4a调控胃癌细胞系BGC823在裸鼠体内的成瘤性,促进肿瘤在裸鼠体内生长,该结果与细胞实验的结果能够相互印证。[结论](1)miR-130a-5p可能在胃癌的发展过程中扮演促癌因子的角色。(2)在胃癌组织及BGC823细胞中,CRMP4a为抑癌基因,CRMP4b为促癌基因,两者在胃癌发展过程中具有相反的作用。miR-130a-5p能够通过抑制CRMP4a的表达,进一步抑制CRMP4b的表达,促进胃癌的发展。(3)在胃癌组织及BGC823细胞中,miR-130a-5p能够通过抑制CRMP4a的表达,解除了 CRMP4a对RhoA表达水平的抑制作用,提高RhoA的表达水平,最终促进胃癌细胞增殖和侵袭,抑制细胞凋亡。