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目的(1)观察大鼠乳腺癌生长分化病理特点及淋巴管生成;(2)合成靶向podoplanin的MRI金磁微粒对比剂,体外观察该纳米粒对比剂理化特性;(3)Podoplanin分子靶向MRI活体显像,评价乳腺癌淋巴管生成。方法(1)利用金磁微粒(GoldMag-Coreshell, GoldMag)兼有磁性粒子的超顺磁性及胶体金偶联生物分子的性能,螯合抗podoplanin抗体合成靶向podoplanin的MRI金磁微粒对比剂(PodAb-GoldMag),螯合非特异性抗体IgG合成含IgG的MRI纳米粒(IgG-GoldMag)为对照,测量螯合前后两种抗体在280nm处吸光值,计算抗体在GoldMag表面的偶联效率;ELISA双抗体夹心法测定纳米粒的免疫活性。(2)用激光粒度仪分别对GoldMag核心微粒超小超顺磁性氧化铁(USPIO)、GoldMag、IgG-GoldMag和PodoAb-GoldMag进行Zeta电位测定;透射电子显微镜观察USPIO、GoldMag和PodoAb-GoldMag纳米粒形态变化并测定其粒径变化。(3)以磷酸盐缓冲液(PBS)为稀释剂将USPIO和GoldMag分别稀释为0.5～1000μg/ml的47个不同的浓度,以PBS液为对照,共获得48个浓度,行FSE T1WI、FSE T2WI和GRE T2*WI磁共振成像。观察不同浓度USPIO和GoldMag在3种序列中的信号强度变化规律,计算信号强度变化比率,绘制浓度-信号强度曲线图。(4)Wistar雌性大鼠80只,二甲基苯蒽(DMBA)灌胃诱发乳腺肿瘤,75只大鼠成功诱发乳腺肿块,随机分为A、B、C、D 4组,A组(PodoAb-GoldMag组)30只大鼠,B组(IgG- GoldMag组)、C组(GoldMag组)和D组(Gd-DTPA组)各15只大鼠。用1.5 T磁共振成像系统分别行FSE T1WI、T2WI、压脂序列、弥散加权成像,A、B、C组分别于注射对比剂前、注射对比剂后即刻、5 min、15 min、30 min、1 h和2 h行乳腺肿块GRE T2*WI增强扫描,D组于相同的时相点行FSE T1WI增强扫描,测量信号强度,绘制动态增强扫描时间-信号强度曲线。(5)扫描完毕后,灌注法固定标本,同一乳腺肿块分别于中央区和周围区取材,HE染色和podoplanin相关抗原免疫组化染色、免疫荧光染色以及普鲁士蓝铁染色,观察乳腺肿瘤病理类型和淋巴管生成情况,同一肿瘤分别观察中央区和周围区2个不同部位淋巴管生成情况。(6)乳腺肿瘤HE染色、免疫组化染色和LVD检查结果与MRI图像对照分析,分析乳腺肿瘤MRI表现的病理学基础,探讨podoplanin分子靶向MRI活体显像评价乳腺癌淋巴管生成的效果。结果(1)成功螯合抗podoplanin抗体与GoldMag,合成靶向podoplanin的PodAb- GoldMag,抗podoplanin抗体与GoldMag的平均结合率为64.81%,抗podoplanin抗体的免疫活性为43%。(2)USPIO的Zeta电位为12.0±18.9 mv,粒径分布范围15~30 nm;GoldMag的Zeta电位为25.2±95.2 mv,粒径分布范围40~80 nm;IgG-GoldMag的Zeta电位为18.2±1.6 mv,PodAb-GoldMag的Zeta电位为25.5±20.8 mv,粒径分布范围80~100 nm。(3)GoldMag与USPIO的MRI信号变化规律基本一致,不同成像序列信号强度比较,随浓度增加,FSE T1WI信号强度呈升高趋势,FSE T2WI信号强度略有下降,GRE T2*WI信号强度明显降低。两种对比剂信号强度比较,在FSE T1WI,浓度高于30μg/ml时信号强度有显著性差异(P <0.05),在FSE T2WI,浓度为40～90μg/ml时信号强度有显著性差异(P <0.05),在GRE T2*WI,两种对比剂信号强度无显著性差异(P >0.05)。(4)75只大鼠成功诱发乳腺肿块,68只大鼠诱发1个乳腺肿块,7只大鼠诱发2个乳腺肿块。75只大鼠中,乳腺增生性疾病21只,炎性肉芽肿2只,乳腺癌52只,乳腺肿块诱发成功率为93.8%,乳腺癌诱发成功率为69.3%。(5)在MRI平扫T1WI,乳腺良、恶性病变均表现为低信号或等信号;在T2WI,乳腺良性病变表现为高信号和等信号为主的混杂信号,乳腺恶性肿瘤中,42只表现为高信号和等信号为主的混杂信号,其余10只表现为低信号为主的混杂信号;在压脂序列T2WI,乳腺脂肪高信号被抑制,良、恶性病变均表现为高信号。(6)GoldMag靶向增强扫描,A、B、C 3组乳腺癌信号强度均在注射对比剂即刻显著下降(P<0.01),并随时间推移逐渐回升,注射后1 h信号强度不再变化,此时A组信号强度较注射前低,其差异有显著性(P<0.05),B、C两组信号强度基本回复到注射前水平,差异无显著性(P>0.05)。不同组织类型乳腺癌信号强度在注射对比剂前后无显著性差异(P>0.05),不同分化程度乳腺癌信号强度在注射对比剂即刻至5min内差异有显著性(P<0.05),其它时间点无显著差异。(7)LVD随乳腺癌分化程度的降低而显著增高(P<0.05),LVD与A组乳腺肿瘤信号降低程度呈显著负相关(r =-0.814,P = 0.000),与B、C两组乳腺癌信号强度降低程度无显著相关性(P>0.05),与D组乳腺肿瘤信号强度增高程度呈显著正相关(r = 0.972,P = 0.000)。结论(1) GoldMag作为一种核壳结构的超顺磁性复合微粒,其核心为USPIO,USPIO与GoldMag MRI信号特点变化相似,随浓度增加,FSE T1WI信号强度呈升高趋势,FSE T2WI信号强度略有下降,GRE T2*WI信号强度明显降低。GRE T2*WI为USPIO和GoldMag的最佳MRI成像序列。(2)成功螯合靶向PodAb-GoldMag纳米粒对比剂,抗podoplanin抗体与GoldMag的平均结合率为64.81%,抗podoplanin抗体的免疫活性为43%,PodAb-GoldMag的Zeta电位为25.5±20.8 mv,粒径分布范围80~100 nm。(3)大鼠诱发性乳腺癌MRI平扫T1WI表现为低信号或等信号;T2WI多数表现为高信号和等信号为主的混杂信号;压脂序列T2WI病变均表现为高信号,与人乳腺癌MRI表现相似。(4)乳腺增生性疾病仅可见少许新生淋巴管和少量较大、较成熟淋巴管。乳腺癌新生淋巴管多位于肿瘤边缘部位癌巢周围的间质中,LVD随乳腺癌分化程度的降低而升高。(5) PodAb-GoldMag增强扫描乳腺癌周边区信号强度降低较中央区明显;不同分化程度和不同组织类型的乳腺癌,PodAb-GoldMag增强扫描信号强度变化基本相似。(6) PodAb-GoldMag靶向增强MRI与肿瘤微淋巴管密度相关,根据大鼠乳腺肿瘤PodAb-GoldMag增强扫描,可初步鉴别其淋巴管生成情况,可活体评价乳腺癌淋巴管生成。