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背景和目的SOX8与SOX9、SOX10共同属于SOXE家族。已有文献报道,视网膜细胞中,调控细胞干性的重要信号通路-Notch与Hedgehog通路的激活与SOX8的表达水平相关。而近期研究显示,SOX8也密切影响着肿瘤的发生发展:SOX8在非小细胞肺癌中的表达受MicroRNA 124调控,其高表达能够促进肿瘤细胞的增殖;同样,肝癌细胞中SOX8的高表达也促进肿瘤细胞的增殖,并且与β-catenin的高表达呈正相关;此外,SOX8还可以作为分子标志提示脑胶质瘤的恶性预后。我们前期研究发现,胰腺导管腺癌组织及细胞系中SOX8表达水平增高,但是否具有临床意义尚不明确。因此,本研究中我们拟结合患者的临床病理资料,评估SOX8在判断胰腺癌预后中的作用,同时检测SOX8在胰腺癌细胞干性维持和化疗敏感性中的作用及可能的作用机制,为胰腺癌的治疗提供新的靶点。方法1.通过TCGA数据库分析正常胰腺组织和胰腺导管腺癌组织中SOX8表达水平差异。同时收集胰腺导管腺癌组织及正常胰腺组织的石蜡标本及相应胰腺导管腺癌患者的临床病理资料,组织切片行SOX8的免疫组织化学染色,由专业病理科医师对其染色进行评分评级,分析正常胰腺组织标本和胰腺导管腺癌组织中SOX8蛋白表达水平的差异,并分析胰腺导管腺癌中SOX8蛋白的表达水平与临床病理参数间的相关性,同时分析不同SOX8表达水平与患者生存期的相关性。2.根据胰腺癌细胞系SOX8基础表达水平分别构建SOX8过表达及降表达的稳转细胞系,采用Western blot法对构建的稳转细胞系进行验证。验证稳转细胞系构建成功后分别通过悬浮成球实验、软琼脂克隆形成实验、CCK8法检测细胞增殖能力、流式细胞术检测失巢凋亡能力、细胞周期及干细胞表面分子CD133表达情况及裸鼠皮下成瘤等实验,明确SOX8不同表达水平对胰腺导管腺癌细胞干细胞特性的影响。利用Western blot法检测不同SOX8稳转细胞系中干性通路相关蛋白β-catenin的表达水平。3.应用流式细胞术检测不同SOX8稳转细胞系经吉西他滨处理后的凋亡率。同时采用CCK8法测定SOX8稳转细胞系对吉西他滨的IC50值。构建裸鼠皮下成瘤模型,验证SOX8对胰腺癌细胞化疗敏感性的影响。4.乏氧处理胰腺癌细胞后分别通过悬浮成球实验、CCK8法检测细胞增殖能力及对吉西他滨的IC50值、流式细胞术检测失巢凋亡能力及应用吉西他滨后的凋亡率,然后降表达SOX8,重复以上实验,明确SOX8在乏氧状态下对胰腺癌细胞干细胞特性及化疗敏感性的影响。5.应用胰腺导管腺癌组织石蜡标本,对SOX8及HIF1a连续切片进行空间共定位染色,检测HIF-1a和SOX8表达的相关性。同时应用Western blot、RT-PCR法检测胰腺癌细胞系中HIF-1a和SOX8表达的相关性。应用CHIP实验检测HIF-1a能否与SOX8直接结合。结果1.TCGA数据库分析发现,胰腺癌中SOX8 DNA水平较癌旁明显升高,并且其升高的程度较SOX家族其他成员(SOX2、SOX9)更为显著。88例胰腺导管腺癌组织标本的免疫组织化学染色发现,SOX8在63.6%的胰腺导管腺癌组织中呈现高表达(56例患者),在36.4%的胰腺导管腺癌组织中低表达(32例患者),而正常胰腺组织则呈阴性表达或弱表达;Spearman相关分析显示SOX8表达与患者术后病理分期、肿瘤大小、淋巴结转移呈正相关,与组织分化程度负相关,差异具有统计学意义。生存分析显示SOX8表达程度与患者的总生存期成负相关(中位数:22 vs 14个月,P<0.01);与无复发生存期也成负相关(中位数:16 vs10个月,P<0.01)。2.SOX8对胰腺导管腺癌细胞干细胞特性的影响。根据胰腺癌细胞系SOX8表达情况构建了2个过表达SOX8的胰腺癌稳转细胞系(PANC-1及CFPAC-1)和2个降表达SOX8的胰腺癌稳转细胞系(CFPAC-1和BxPC-3),并通过Western blot法对稳转细胞系进行了验证。体外悬浮培养胰腺癌稳转细胞系,结果显示过表达SOX8的稳转细胞系,悬浮成球大小与数目均明显高于其空载对照组,软琼脂克隆形成数目及大小也明显高于其空载对照组;降表达SOX8的稳转细胞系的悬浮成球大小与数目明显低于其空载对照组,软琼脂克隆形成数目及大小也明显低于其空载对照组。CCK8法检测细胞增殖能力发现过表达SOX8稳转细胞系的细胞增殖能力较空载对照组增强,降表达SOX8稳转细胞系细胞增殖能力较对照组降低。流式细胞术检测胰腺癌细胞系失巢凋亡率,结果显示过表达SOX8的稳转细胞系失巢凋亡率较空载对照组降低,降表达SOX8的稳转细胞系失巢凋亡率较空载对照组增高。同时,利用流式细胞术检测过表达SOX8稳转胰腺癌细胞系CD133阳性细胞比率明显高于其空载对照组,但SOX8表达情况对细胞周期没有影响。裸鼠皮下成瘤实验显示降表达SOX8的胰腺癌细胞系皮下成瘤能力较空载对照稳系降低。SOX8的稳转细胞系中β-catenin表达水平与SOX8表达水平呈正相关。3.吉西他滨处理SOX8的胰腺癌稳转细胞系,流式细胞术检测显示降表达SOX8的稳转细胞系的凋亡比例明显高于其空载对照组(P<0.05)。CCK8法细胞毒性检测结果显示降表达SOX8的稳转细胞系的IC50值明显低于其空载对照组(P<0.05)。裸鼠皮下成瘤后吉西他滨对降表达SOX8的稳转细胞系的抑瘤率明显高于空载对照细胞系。4.乏氧处理胰腺癌细胞系后,其体外悬浮成球大小与数目明显高于常氧组,CCK8法检测细胞增殖能力也高于常氧组,流式检测其失巢凋亡能力低于常氧组,吉西他滨处理后的凋亡率低于常氧组,CCK8法检测其对吉西他滨的IC50值升高。但在此基础上降表达SOX8后,增强的体外悬浮成球能力、细胞增殖能力均降低,失巢凋亡率增加以及对吉西他滨的敏感性增强,总之乏氧处理后的变化趋势均消失或减弱。5.我们对该研究中的88例胰腺导管腺癌组织标本行HIF-1a免疫组织化学染色发现,SOX8与HIF-1a的表达在胰腺癌组织中呈现共定位,并有明显的正相关性(r=0.331,P<0.01)。构建胰腺癌细胞系过表达或降表达HIF-1α的稳转细胞系,Western blot、RT-PCR检测发现HIF-1α与SOX8无论是在蛋白水平还是在mRNA水平上均呈现正相关。生物信息学分析发现SOX8的启动子区存在HIF-1a的6个HRE结合区域。而后我们选取Panc-1胰腺癌细胞系,通过染色质免疫共沉淀技术发现HIF-1α可直接结合于SOX8的启动子区。结论1.SOX8在胰腺导管腺癌组织中表达升高,且表达水平与患者病理分期、肿瘤大小、淋巴结转移呈正相关,与组织分化程度呈负相关,SOX8高表达水平与患者不良预后相关,对胰腺癌的预后判断具有一定价值。2.SOX8表达升高可以增强胰腺癌细胞的干细胞特性,降低化疗敏感性,可能与激活干性通路相关蛋白β-catenin有关。3.乏氧微环境可以增强胰腺癌干细胞特性,降低化疗敏感性,在此基础上降表达SOX8能明显削弱该现象,提示胰腺癌乏氧微环境对胰腺癌细胞干性与化疗敏感性的影响很大程度上是由SOX8介导的。4.在胰腺癌中HIF-1a能直接结合于SOX8的启动子区,正向调控SOX8的表达。