一、研究背景糖蛋白的异常糖基化在多种恶性肿瘤的发生、发展、转移中起重要作用。糖基转移酶以膜结合的形式存在于细胞高尔基体内,由受到特定蛋白酶刺激的细胞分泌产生。β1,6-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(N-acetylglucosaminyl-transferase-V, GnT-V)是催化N-连接糖蛋白糖链加工合成β1,6分支形成中的重要关键酶,很多报道证明它与肿瘤的分化、侵袭及转移能力高度相关。GnT-V可以通过不同的方式来参与肿瘤细胞进展的过程,包括提高细胞的增殖能力和抑制细胞体内的自主凋亡,有研究表明,GnT-V与上皮间质转化(EMT)中的重要标志E-钙粘蛋白功能紊乱有关系,可能与肿瘤细胞的远处转移密切相关。目前的研究表明,GnT-V在不同的肿瘤细胞中,呈现的作用是不一样的,比如在肝癌、乳腺癌、结肠癌中为高度恶性的表现,而在非小细胞癌、膀胱癌的临床研究中则发现,低表达的GnT-V与预后良好相关。肺癌仍然是现在最常见的恶性肿瘤之一。小细胞肺癌(SCLC)占肺癌大约20%的比例,是恶性程度最高的一种子类型,近几年的发病率有所升高。SCLC的发生与吸烟高度相关,并且倾向较早发生远处转移和播散,预后不好。化学治疗和放射治疗可以改善许多患者的生存情况,但是它初始化放疗敏感,随后却很快耐受的特点,导致了它总体预后不良的,生存期短。因此,了解疾病进展过程中的变异以及治疗的有效性很重要。最近的研究表明,相关的信号转导分子家族(PI3K/AKT/mTOR信号转导途径)、原癌基因(Bcl-2,MYC)、抑癌基因(p53, RB, PTEN)均与SCLC的发病有一定关系。现在仍未有早期可检测诊断的方法或者可行的靶向治疗,SCLC的治疗仍然具有很大的挑战性,寻找一种有效可行的与耐受相关的靶分子显得尤为重要。诸多的研究证明,GnT-V与肿瘤的恶性程度密切相关,而其在小细胞肺癌中放射治疗耐受的情况仍未明了。在本实验中,我们通过下调或者上调GnT-V在小细胞肺癌细胞株中的表达,来观察GnT-V的表达改变是否对小细胞肺癌的放射治疗敏感性有影响。二、研究目的此前,本课题组通过体内、外的实验研究比较下调GnT-V表达前后小细胞肺癌细胞株H69AR等细胞的增殖、凋亡情况,发现下调GnT-V表达可以增加小细胞肺癌细胞株的放射治疗敏感性,并进一步研究其中可能涉及的相关机制。但是上调GnT-V表达是否对小细胞肺癌放射治疗敏感性有影响未被研究。在本实验中,我们利用shRNA构建低表达GnT-V的小细胞肺癌细胞株H1688/1079/sh、 H1688/1564/sh、H146/1079/sh以乃H146/1564/sh,同时我们首次利用MGAT5构建高表达GnT-V的小细胞肺癌细胞株H1688/mgat5和H146/mgat5。通过体外实验(CCK-8增殖实验、细胞划痕迁移实验、平板克隆实验)研究对比正常的H1688、H146细胞与干扰GnT-V后的H1688、H146细胞的放射敏感性之间的差异。三、实验方法1、细胞的培养及转染人小细胞肺癌细胞株H1688、H146培养置于37℃含5%CO2浓度的培养箱中,将细胞常规培养于含胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养液中,H1688用10%FBS, H146用含15%FBS,每周传代2-3次。pGPU6/GFP/Neo GnT-V sh-RNA和GV230/EGFP/Neo MGAT5质粒载体从上海基因公司获得。待细胞培养至生长旺盛的对数生长期时,严格按照Invitrogen公司生产的Lipofectamine2000TM产品试剂盒说明书,用脂质体Lipofectamine2000TM将预先构建的质粒载体分别导入H1688及H146细胞中,同时分别用G418浓度为400μg/ml或者2000μg/ml来筛选阳性细胞克隆(有抗药性,同时具有相应质粒的表达功能)。分别统一命名为H1688组(H1688、H1688/NC/sh、H1688/1079/sh、H1688/1564/sh、 H1688/NC/mgat5、H1688/mgat5), H146组(H146、H146/NC/sh、H146/1079/sh、 H146/1564/sh、H146/NC/mgat5、H146/mgat5)。2、干扰效果检测(1)采用RT-PCR测定GnT-VmRNA用Trizol (RNA抽提试剂)来提取对数生长期的单层培养细胞总的RNA物质,采用逆转录的方法合成用于扩增的cDNA。RT-PCR采用的引物序列如下：GnT-V上游的引物序列为(Gnt-V_primer_F)5’GAGCAGATCCTGGACCTCAG3’,下游的引物序列为(GNT-V_primer_R)为5’GCTGTCATGACTCCAGCGTA3’.我们用GAPDH管家基因作为内参,GAPDH上游的引物序列为5’GCACCGTCAAGGCTGAGAAC3’, GAPDH下游的引物序列为5TGGTGAAGACGCC AGTGGA3’.反应条件按引物作用环境设定为：95℃预变性30s, PCR:95℃5s,60℃30s,一共40个循环,溶解曲线：95℃15s,55℃45s,95℃15s。RT-PCR结果的判读,根据实时荧光定量扩增曲线可以得到每个基因的CT值(荧光达到设定的阈值时所经历的循环数),比较检测目的基因和管家基因的CT值的差异-△CT值,进而比较实验组与对照组目的基因ACT值的差异-△△Ct值,并用Folds=2-△△C来呈现实验组目的基因的表达量与对照组目的基因表达量之间的相关倍数关系。本实验中目的基因为GnT-V,内参基因为GAPDH。具体公式如下：ACT=Ct目的基因-Ct内参基因；△△Ct=△CT实验组-ACT对照组(2)用Western blot免疫印迹的方法检测GnT-V蛋白表达用蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白,并用BCA检测法测定总蛋白的浓度,用加样枪吸取40μg总蛋白,去离子水补至20μL,加入1/4体积5xSDS上样buffer液体煮沸5分钟,离心后吸取15μL上凝胶电泳孔,经不连续SDS-PAGE电泳分离后,用湿转法把分离后蛋白转移至PVDF膜上,5%脱脂奶粉常温封闭2h,TBST洗膜后用一抗4℃孵育过夜,分别包括鼠抗人GnT-V蛋白单克隆抗体(1：200)、鼠抗人GAPDH蛋白单克隆抗体(1：1000)。次日,洗膜后加入HRP标记的二抗,分别包括羊抗鼠IgG (1:500)、HRP标记的羊抗鼠IgG (1:2000),37℃孵育1h,洗膜后采用ECL化学发光试剂浸润PVDF膜,10分钟后暗室曝光并用显影定影液冲洗胶片。利用UVI凝胶成像系统摄像,采用Image-Pro Plus6.0软件检测分析条带灰度值,用GnT-V/GAPDH代表GnT-V的相对表达量,并比较试验组与对照组的差异。3、干扰GnT-V表达后对小细胞肺癌细胞株H1688及H146放射敏感性的影响(1)CCK-8法测定pGPU6/GFP/Neo GnT-VshRNA、GV230/EGFP/Neo MGAT5干扰后对H1688和H146细胞单次6Gy照射后增殖能力的影响。取各组对数生长期的待测肿瘤细胞,通过消化,重悬制备单个细胞悬液,计数,H1688细胞每孔接种3×103个细胞,H146细胞每孔接种2×104个细胞到96孔细胞培养板中,每组细胞6个复孔,共铺5块板,同时置于37-C5%CO2条件下静止培养,24h后给予6Gy照射。照射后于不同时间点(Oh、24h、48h、72h、96h)分别用CCK-8法检测各组细胞增殖活力。测量各组细胞的OD450nm值,绘制生长存活率曲线=(干扰组OD450值-空白对照组OD450值)/(对照组OD450值-空白对照组OD450值)×100%。实验分为2个大组,分别为H1688组(H1688、H1688/NC/sh、H1688/1079/sh、H1688/1564/sh、 H1688/NC/mgat5、H1688/mgat5)和H146组(H146、H146/NC/sh、H146/1079/sh. H146/1564/sh、H146/NC/mgat5、H146/mgat5),每组重复例数为18。(2)用划痕迁移实验检测pGPU6/GFP/Neo GnT-VshRNA、GV230/EGFP/Neo MGAT5干扰后对H1688、H146细胞单次6Gy照射后迁移能力的影响。取各组对数生长期的待测肿瘤细胞,接种到6孔培养板中,H1688细胞每孔接种4×105个细胞,H146细胞每孔接种1×106个细胞,同时置于37℃5%CO2条件下静止培养,待细胞融合率达100%时划痕,并给予6Gy照射。照射后,因细胞的增殖能力不一样,H1688于照射后不同时间点(0h、12h、24h)在同一位置拍照,而H146于照射后不同时间点(0h、48h、96h)在同一位置拍照,并用Image-Pro Plus6.0软件测量划痕距离,计算划痕愈合率。实验分为2个大组,分别为H1688组(H1688、H1688/NC/sh、H1688/1079/sh、H1688/1564/sh、 H1688/NC/mgat5、H1688/mgat5)和H146组(H146、H146/NC/sh、H146/1079/sh、 H146/1564/sh、H146/NC/mgat5、H146/mgat5),每组重复例数为9。(3)平板克隆形成实验检测pGPU6/GFP/Neo GnT-VshRNA、 GV230/EGFP/Neo MGAT5干扰后对贴壁细胞H1688照射后克隆形成能力的影响取各组对数生长期的待测细胞,接种于6孔板,每孔300个细胞,24h后分别给予OGy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy五个剂量点照射,然后置于37℃含5%CO2条件的培养箱内静止培养,待出现肉眼可见克隆时,终止培养,约10天左右。其后加入4%多聚甲醛固定15min,晾干后用0.1%的结晶紫染色20min,并计数细胞数大于50个的克隆总数。通过克隆数计算出细胞生存分数。实验H1688组(H1688、H1688/NC/sh、H1688/1079/sh、H1688/1564/sh、H1688/NC/mgat5. H1688/mgat5)每组重复例数为9。4、统计学分析所有的实验结果均经SPSS13.0软件统计。用均数±标准差来显示数据的结果。以P<0.05表示有统计学意义。实时定量RT-PCR及Western-Blot实验结果多组间比较采用完全随机设计的方差分析。CCK8细胞增殖实验、划痕迁移实验及平板克隆实验,采用析因设计的方差分析。参数比较均先进行方差齐性检验,若方差不齐,则用基于方差不齐的近似F检验Welch法。多重比较方法的选择,如果方差齐,则选用LSD的比较方法,如果方差不齐,则采用Dunnett T3多重比较的方法检验分析。其中实时定量RT-PCR及Western-Blot检测结果分析取三次实验结果总的平均值,把实验组换算成对照组的相对百分比进行统计。四、结果1、重组质粒的稳定转染质粒pGPU6/GFP/Neo GnT-VshRNA、GV230/EGFP/Neo MGAT5中含有编码GFP绿色荧光蛋白的基因,故转染细胞在荧光显微镜下可激发出绿色荧光。另外,质粒中的Neo基因同时赋予转染细胞G418抗性。因此,通过脂质体Lipofectamine2000TM将含有GnT-V shRNA、MGAT5的质粒分别导入H1688及H146细胞后,在荧光显微镜下观察,所有转染细胞均发荧光,并且可在含G418培养基中稳定传代,说明稳定转染成功(图3-1A-B)。2、干扰效果检测实时定量RT-PCR实验结果得出在下调GnT-V基因组(H1688/1079/sh、 H1688/1564/sh)细胞中,GnT-V基因的mRNA表达较对照组(H1688、H1688/NC/sh)明显降低,表明转染GnT-VshRNA载体能抑制目的基因mRNA表达；同时在上调GnT-V基因组H1688/magt5的细胞中,GnT-V基因的mRNA表达较对照组(H1688、H1688/NC/mgat5)明显升高,表明转染GnT-V MGAT5载体能提高目的基因mRNA表达。在H146组细胞间转染同样功能的质粒,也得出对应抑制或者升高目的基因GnT-V mRNA的表达。Western blot结果也分别显示,在转染GnT-VshRNA载体质粒后的H1688和H146细胞中,GnT-V蛋白表达能被明显抑制,而转染GnT-V MGAT5载体后的H1688和H146细胞中,GnT-V蛋白表达则能被显著提高。Image-Pro Plus6.0软件分析GnT-V基因mRNA及蛋白的表达水平,按照公式进行计算后显示H1688/1079/sh、H1688/1564/sh组]mRNA水平的抑制率分别为58%和66.9%,蛋白水平的抑制率分别为53.2%和58.8%；与H1688、H1688/NC/sh组比较有统计学意义(P<0.05)。同时H1688/magt5提高GnT-V基因mRNA表达为7.173倍,促进蛋白表达为1.805倍,与H1688、H1688/NC/mgat5组相比均有统计学意义(表3-1,图3-2A)(P<0.05)。而H146/1079/sh、H146/1564/sh组mRNA水平的抑制率分别为58.9%和49.6%,蛋白水平的抑制率分别为54.1%和44.9%；与H146、H146/NC/sh组相比,有统计学意义(P<0.05)。而H146/mgat5提高GnT-V基因mRNA表达为3.157倍,促进蛋白表达为1.717倍,与H146、H146/NC/mgat5组相比均有统计学意义(表3-2,图3-2B)(P<0.05)。3、GnT-VshRNA、GnT-V MGAT5对细胞放疗前后增殖、迁移能力的影响(1)以细胞在6Gy放疗后不同时间点(Oh、24h、48h、72h、96h)绘制细胞生长曲线,H1688/1079/sh及H1688/1564/sh组的细胞存活率较H1688组及H1688/NC/sh组低,说明下调GnT-V的表达可增强放疗对H1688细胞的生长增殖抑制的作用(P<0.05)。H1688/magt5组的细胞存活率较H1688组及H1688/NC/mgat5高,说明上调GnT-V的表达可降低放疗对H1688细胞的生长增殖抑制的作用(表3-3,图3-3A)(P<0.05)。H146组细胞也可以得到同样的结果(表3-4,图3-3B)。(2)以H1688细胞在6Gy放疗后不同时间点(0h、12h、24h)及H146细胞在6Gy放疗后的不同时间点(0h、48h、96h)分别各自测量划痕距离,H1688/1079/sh及H1688/1564/sh组的划痕愈合率较H1688组及H1688/NC/sh组低；可见下调GnT-V的表达可进一步抑制H1688细胞放疗后细胞的迁移能力。而H1688/magt5组的划痕愈合率较H1688组及H1688/NC/mgat5高,可见上调GnT-V的表达可进一步降低放疗对H1688细胞迁移能力的影响(表3-5,图3-4A,3.-4C)。H146组细胞也可以观察到同样的结果(表3-6,图3-4B,3-4D)。(3)以细胞在不同照射剂量(OGy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy)的克隆形成率绘制细胞生存率曲线,H1688/1079/sh及H1688/1564/sh组的生存率较H1688组及H1688/NC/sh组低,说明下调GnT-V的表达可进一步抑制H1688细胞放疗后的克隆形成能力(P<0.05)。而H1688/magt5组的生存率较H1688组及H1688/NC/mgat5高,说明上调GnT-V的表达可以降低放疗对H1688细胞克隆形成能力的影响(表3-7,图3-5A-B)(P<0.05)。五、结论1、靶向GnT-V的shRNA真核表达质粒可以下调小细胞肺癌H1688及H146细胞GnT-V的mRNA和基因蛋白表达；2、靶向GnT-V MGAT5可以上调小细胞肺癌H1688及H146细胞GnT-V的mRNA和基因蛋白表达。3、干扰GnT-V的表达可以影响小细胞肺癌细胞的体外放射治疗的敏感性。下调GnT-V的表达可以增强SCLC的体外放射治疗敏感性,上调GnT-V的表达可以降低SCLC的体外放射治疗敏感性。4、GnT-V基因可能成为小细胞肺癌治疗的靶点。