论文部分内容阅读
定向分子进化是探索研究生物大分子结构与功能的重要手段，同时也是改造、优化生物大分子特性的有效方法。噬菌体展示及筛选和DNA重排是体外定向分子进化的重要核心技术。proteinA和protein L是两种不同的细菌表面蛋白，均可与Ig结合，但各自有不同的特点。本研究应用DNA重排技术将protein A的单个抗体结合结构域和protein L的单个抗体结合结构域随机组合，构建了重组Ig结合多肽PALn分子文库，并采用噬菌体展示技术结合体外定向进化IgG亲和筛选，探究Ig结合分子的结构和功能的关系，同时为定向改造Ig结合分子打下基础。本研究分四个部分：一、新型噬菌体展示载体pCANTAB5S的构建；二、噬菌体展示Ig结合多肽PLn分子文库的构建及筛选；三、噬菌体展示Ig结合多肽PALn分子文库的构建及筛选；四、（MDPL-MDPA）n代表分子的原核表达、纯化及功能鉴定。 一、新型噬菌体展示载体pCANTAB5S的构建 通过基因操作，将限制酶切位点SacI引入到噬菌体展示载体pCANTAB5L，并校正了pCANTAB5L载体Stu Ⅰ、Sal Ⅰ等位点的读框。具体过程是：以pCANTAB5X-IFN-α2b重组质粒为模板，在上游引物中引入XbaⅠ、Sac Ⅰ酶切位点，在下游引物中引入Sac Ⅰ、StuⅠ、Sal Ⅰ酶切位点，将用该引物扩增的IFN-α2b衔接片段PCR产物克隆到pMD18-T中，再将该片段用Xba Ⅰ和Sal Ⅰ酶切并将之插入pCANTAB5L的Xba Ⅰ和Sal Ⅰ位点中，经SacⅠ酶切，线性载体片段自连，构成新型噬菌体展示载体pCANTAB5S。序列分析证明pCANTAB5S在pCANTAB5L原有Xba Ⅰ和Stu Ⅰ之间引入Sac Ⅰ位点，并校正了原Stu Ⅰ的读框，有利于各种外源随机多肽和功能蛋白的有效展示。 二、噬菌体展示Ig结合多肽PLn分子文库的构建及筛选 用含Sac Ⅰ位点的特定引物PCR扩增protein L的B3抗体结合结构域（L），Sac Ⅰ酶切后，经DNA重排连接形成各种不同长度的PLn随机分子库，并将该文库呈现在噬菌体表面，构建了噬菌体展示Ig结合多肽PLn文库。所建肽库容量为3×105个菌落形成单位，滴度为6.2×1010TU／ml。通过三轮IgG亲和筛选，选择后的12个阳性克隆DNA测序分析显示8个为2L序列，1个为L序列，证实了protein L的单个B结构域具有Ig结合功能，2个重复protein L的B结构域序列形成的分子具有良好的IgG结合能力。结果表安徽医科大学硕士学位论文明应用分子进化手段研究Ig结合分子的结构和功能是可行的。 三、噬菌体展示Ig结合多肤PALn分子文库的构建及筛选 用含Sacl位点的特定引物PCR分别扩增ProteinA的A，B，C，D4个抗体结合结构域和proteinL的B3抗体结合结构域，Sacl酶切后，经DNA重排连接形成各种不同长度的PALn随机分子文库，并将该文库呈现在噬菌体表面，构建了噬菌体展示19结合多肤队Ln文库。所建肤库容量为2.3、106个菌落形成单位，滴度为4、1、10”Tu/ml。通过四轮IgG亲和筛选，选择后的36个阳性克隆序列分析显示:20个序列为特征性的由proteinL的单结构域和ProteinA的单结构域间隔重组排列而成的（MDPL一MDPA）n结构。结果证实分子进化技术是研究Ig结合分子的结构和功能关系的有效方法和手段，同时发现（MDPL一MD队）n结构可能是具IgG结合能力的分子的一种重要的结构形式。 四、（MDPL一MDPA）n代表分子的原核表达、纯化及功能鉴定 PCR扩增（MDPL一MD队）n代表分子一LD3，LDS序列及PLn（PALn）库选择阳性序列ZL，在上游引物中引入Neol位点，PCR扩增产物用Neol和sall酶切，ZL，LD3，LDS序列被克隆于表达载体PET32a（+）的Ncol和Sall位点中，原核表达N端带His一Tag的融合蛋白，Ni一NTA柱亲和层析纯化，W己stem Blot鉴定，ELISA检测证实（MDPL一MDPA）n分子有很好的IgG结合活性，与队Ln噬菌体展示文库的筛选结果一致;纯化蛋白IgG结合活性趋势比较:LDS>LD3>S队>ZL，结果显示结构域组成数越多，IgG结合活性越高，为研究Ig结合分子结构和功能的关系提供了一些依据。 本研究首次构建ProteinA和ProteinL的单结构域重组分子文库，并与噬菌体筛选技术相结合研究Ig结合分子的结构和功能，最终成功获得多种Ig结合多肤序列，发现了一种新的Ig结合分子结构形式（MDPL一MDPA）n，原核表达、纯化了（MDPL一MD队）n代表分子，证实其具备良好的IgG结合活性，并揭示了其功能和结构的一些联系。本研究为应用分子进化手段研究蛋白质分子的结构和功能的关系提供了成功实例，为噬菌体展示技术在蛋白质分子进化中的应用提供了新的可借鉴方法;同时为Ig结合分子的定向改造和高亲和力Ig结合分子的获得奠定了基础。