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乳糖酶是一种水解酶,目前主要应用于食品、医药、分析等领域。本研究以酶工程实验室所保存的一株黑曲霉D2-26为出发菌株,采用10L发酵罐发酵生产乳糖酶,建立了一套简单易行的乳糖酶提取纯化方法并对纯酶的酶学性质进行了详细研究。黑曲霉D2-26乳糖酶是胞外高温乳糖酶,具有生产成本低、提取纯化工艺简单、稳定性好、在生产中可以有效防止杂菌污染等特点,具有广阔的应用前景。 黑曲霉D2-26乳糖酶经过滤、超滤、硫酸铵分级盐析、Sephadex G-25脱盐、DEAE-纤维素-32离子强度梯度层析、Sephadex G-100凝胶过滤、DEAE-纤维素-32pH梯度层析等纯化工艺分离纯化之后,经PAGE电泳鉴定得到单一条带,达到电泳纯。比活力提高到705.91U/mg,比初始发酵液比活提高了43.7倍多。 纯化的黑曲霉D2-26乳糖酶以ONPG为底物时的酶学性质为:最适温度70℃,作用温度较广,在40～70℃都具有较高的酶活性;在30～60℃有较高的耐受性,在30～50℃范围内处理120min,残留酶活均在90%以上,在60℃下处理相同时间其其残留酶活为73.42%;在4℃冷藏条件下具有良好的稳定性,乳糖酶蛋白在低温贮存20天后酶活才开始降低;最适pH为2.5,作用范围较宽,在pH2～4.5范围内均具有较高的酶活性:在pH2～9条件下贮存2d其相对酶活力均在70%以上,具有较好的pH耐受性:Mn2+对乳糖酶有显著激活作用,可使其酶活提高44.94%,并且许多金属离子都能够在一定程度上提高其酶活性,Hg2+、Pb2+对酶活有较强的抑制作用:SDS对酶蛋白的变性作用严重抑制其酶活性,半乳糖对黑曲霉D2-26乳糖酶有一定的产物抑制作用,EDTA不影响乳糖酶的活性:以ONPG为底物采用双倒数作图法测得Vmax为97nmol/min,Km为8.77mmol/L;SDS-PAGE电泳显示黑曲霉D2-26乳糖酶分子量116.978KD,为单亚基蛋白;硫酸-苯酚法测得其糖基化程度为11.3%。 本论文对乳糖酶的分离纯化、酶学性质做了基础性研究,为其工业化生产打下了基础。