论文部分内容阅读
目的：采用抗体蛋白芯片技术观察针刺督脉经(穴)对缺血损伤脑组织修复过程中相关信号蛋白磷酸化的变化,找出与上述过程关系最为密切的信号分子及通路,采用免疫印迹(Western-Blotting)法对该通路中关键蛋白的磷酸化水平进行检测,探讨针刺督脉经(穴)对脑组织缺血性损伤可能的修复机制。方法：32只SD大鼠随机抽取8只作为假手术组,其他24只采用线栓法制备大脑中动脉阻塞(MCAO)大鼠模型后,随机分为3组,即模型组、针刺对照点组、针刺穴位组,8只／组。本研究分为三个部分,第一部分：6次治疗后先行神经功能缺损评分再处死,对大鼠部分脑组织采用HE染色行脑组织细胞形态学观察。第二部分：提取缺血脑组织细胞,采用720磷酸化抗体蛋白芯片技术检测针刺治疗后的脑组织损伤修复相关信号蛋白磷酸化的变化,筛选出各组差异性表达的蛋白。第三部分：应用Western-Blotting方法检测大鼠缺血脑组织细胞磷酸化的丝裂原活化的蛋白激酶激酶的激酶(MAPKKK即Raf)蛋白(p-Rafl)和磷酸化细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)蛋白(p-ERK)的表达。结果：1.针刺穴位可明显降低MCAO大鼠神经功能缺损评分、改善缺血损伤脑组织形态：模型组、针刺对照点组、针刺穴位组神经功能缺损评分明显高于假手术组(P<0.01),且三组的神经细胞及脑组织结构较假手术组均有不同程度的结构破坏、变性坏死；针刺对照点组神经功能缺损评分低于模型组(P<0.05),且神经细胞的结构破坏、脑组织的变性坏死较模型组减少；而针刺穴位评分明显低于模型组(P<0.01)且低于针刺对照点组(P<0.05),且针刺穴位组神经细胞的结构破坏、脑组织的变性坏死较模型组与针刺对照点组均减少。2.缺血脑组织细胞720抗体蛋白芯片检测结果显示：与假手术组比较,模型组的蛋白磷酸化水平变化大于1.5倍的蛋白中有48种出现上调,29种出现下调；与模型组比较,针刺对照点组蛋白磷酸化水平变化大于1.5倍的蛋白中有35种出现上调,24种出现下调：针刺穴位组中有28种出现上调,51种出现下调；与针刺对照点组比较,针刺穴位组中出现调整的蛋白在数量、功能种类与信号转导通路的归属上均明显优于针刺对照组。且MAPKS信号传导途径中关键蛋白均被激活。3.与假手术组比较：模型组和针刺对照点组的p-Rafl含量有升高的趋势,针刺穴位组p-Rafl含量有降低的趋势,但均无统计学差异(P>0.05)；与模型组比较：针刺对照点组的p-Rafl含量增高,而针刺穴位组的p-Rafl含量降低,均无统计学差异(P>0.05)；与针刺对照点组比较：针刺穴位组的p-Rafl含量降低,且低于假手术组和模型组,但无统计学差异(P>0.05)。4.与假手术组比较：模型组和针刺对照点组的p-ERK含量有升高的趋势,针刺穴位组p-ERK含量有降低的趋势,但均无统计学差异(P>0.05)；与模型组比较：针刺对照点组和针刺穴位组的p-ERK都低于模型组,均无统计学差异(P>0.05)；与针刺对照点组比较：针刺穴位组的p-ERK含量低于针刺对照点组,且低于假手术组和模型组,但无统计学差异(P>0.05)。结论：1.针刺大椎、百会、人中(穴)能明显改善MCAO大鼠的神经功能缺损和缺血损伤脑组织形态。提示针刺大椎、百会、人中(穴)对缺血损伤脑组织具有一定的保护作用。2.针刺大椎、百会、人中(穴)可调整造模后失调的与凋亡有关蛋白的磷酸化水平,此外,还可调整多个其它功能种类的蛋白,且涉及到的信号转导通路归属于细胞周期信号转导通路、MAPKS信号途径、细胞凋亡信号途径、黏附分子信号途径、非受体酪氨酸激酶信号途径、受体酪氨酸激酶信号途径等多条信号转导通路。提示多靶点、多条信号转导通路的激活是针刺大椎、百会、人中(穴)促缺血损伤脑组织修复的重要特征。3.各通路中只有MAPKS信号传导途径中的关键蛋白被激活,提示MAPKS信号转导通路与针刺大椎、百会、人中(穴)对缺血损伤脑组织修复密切相关。4.针刺大椎、百会、人中(穴)能降低p-Raf1和p-ERK在缺血损伤脑组织中的表达,对缺血性脑损伤起到一定的修复作用。