草鱼NLK2磷酸化MAVS负调控Ⅰ型干扰素表达

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MAVS(mitochondrial antiviral signaling)作为锚定于线粒体膜表面的接头蛋白,是RLR介导的抗病毒先天免疫信号传导中的关键因子。在进入细胞的RNA病毒的刺激下,RIG-1(retinoic acid inducible gene I)活化,其空间结构发生改变,CARD结构域(caspase recruitment domain)发生暴露,并与MAVS的CARD结构域结合,从而使MAVS形成阮病毒样聚集体,并且作为上游平台蛋白,最终开启抗病毒先天免疫反应。NLK2(Nemo-like kinase 2)基因是Nemo基因的脊椎动物同源物,类似于基因MAPK1/ERK2,可以磷酸化蛋白脯氨酸残基前的丝氨酸和苏氨酸残基。在哺乳动物中,NLK2与MAVS结合并使其磷酸,最终诱导MAVS降解。然而鱼类NLK2与MAVS之间的关系鲜有报道。为了研究鱼类NLK2在免疫反应中的功能,我们利用同源克隆扩增并鉴定了草鱼NLK2基因。草鱼NLK2的完整CDS序列为1281bp,编码一条含427个氨基酸的多肽。系统进化树分析表明,从NCBI中下载的19种物种中,草鱼NLK2与鲤鱼NLK的亲缘关系最为密切。分别用LPS,GCRV和poly I:C作为刺激源处理草鱼,发现NLK2不参与LPS诱导的信号转导,但能够响应GCRV和poly I:C刺激。根据这些实验结果,我们可以初步推测NLK2在先天免疫中发挥功能。另外过表达和干扰实验也表明草鱼NLK2可以抑制IFN Ⅰ(interferon I)的表达。我们要研究NLK2在先天免疫中的作用,必先了解其在细胞中的分布。通过共聚焦显微镜观察到,草鱼NLK2既存在于细胞质中,也存在于细胞核中,主要位于细胞质中。为了探讨草鱼NLK2抑制I型干扰素的具体分子机制,在CO(Grass carp overy cells)细胞中过表达或干扰NLK2,发现它抑制IRF3(interferon regulatory factor 3)的磷酸化。这表明草鱼NLK2可能通过作用于IRF3的上游从而抑制干扰素信号转导。接下来在CO细胞中共转草鱼MAVS和NLK2,CO-IP实验证明它们之间能够发生相互作用。随后,我们将草鱼NLK和MAVS单独或共同转染到CIK(Grass carp kidney cells)细胞中。发现过表达草鱼MAVS,IFN Ⅰ的表达明显增加,过表达草鱼NLK2,IFN Ⅰ表达下降。与单独过表达NLK2相比,NLK2和MAVS共转后IFN Ⅰ的表达增加。这表明过表达MAVS可防止NLK2诱导的IFN Ⅰ下调。干扰MAVS后,无论NLK2是否过表达,与对照组相比,IFN Ⅰ的表达均无变化。这充分说明草鱼NLK2通过作用于MAVS抑制草鱼的先天免疫。为了研究NLK如何通过MAVS抑制先天免疫,过表达NLK2,发现MAVS发生了降解,并且NLK2会磷酸化MAVS。综上可知,草鱼NLK2与MAVS形成复合物之后会磷酸化MAVS,从而影响了MAVS的稳定性,导致MAVS降解,最终调控先天免疫反应。
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