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随着人们生活水平的提高,人们对牛奶的需求量越来越大导致奶牛数量的不断增多,由于管理不当或饲喂不合理或其他因素导致奶牛蹄叶炎的发病率很高,尤其是夏季,对奶牛行业的发展造成了很大的损失。但是人们对蹄叶炎的病因和发病机理尚未明确,对蹄叶炎的治疗也没有一个确切的方法。因此,开展蹄叶炎发病机理的研究对促进奶牛行业的发展具有很大的现实意义。
本试验通过对采取的蹄叶炎和健康奶牛蹄真皮组织进行转录组测序,并对测序结果进行GO富集分析和KEGG分析,筛选出关于蹄叶炎的差异基因和差异基因富集较多的通路,对选择的差异基因进行原组织的qRT-PCR验证,最终筛选出跟奶牛蹄叶炎相关的目的基因;然后通过NCBI获得目的基因的(鼠源)基因序列,通过网站http://chopchop.cbu.uib.no/设计敲除靶点,本试验借助pSMART-LCKan载体,将设计的敲除靶点连接到lenticrisprv2质粒载体上,并通过凝胶电泳、菌液PCR、测序、酶切鉴定验证是否连接成功,最终得到构建好的特异于小鼠的CRISPR/Cas9敲除表达载体;之后将构建好的特异于小鼠的CRISPR/Cas9敲除表达载体转染至小鼠成纤维细胞中并设置空白组、空载体组进行对照,48h后用嘌呤霉素进行筛选,然后收集细胞通过westernblot比较敲除组和对照组细胞中目的蛋白的表达量。
本试验对挑选出的7个差异基因进行原组织qRT-PCR验证,与胰岛素相关的IGF-1R基因表现出差异极其显著(P<0.01),结果与测序结果倍数差异基本一致,成功筛选出目的基因IGF-1R;在构建CRISPR/Cas9敲除表达载体试验中,凝胶电泳、菌液PCR、测序、酶切鉴定结果与预期结果相符,表明特异于小鼠IGF-1R基因的CRISPR/Cas9敲除表达载体构建成功;通过westernblot比较敲除组(试验组)和对照组(空白组、空载体组)细胞IGF-1R蛋白的表达量,结果显示敲除组IGF-1R蛋白表达量明显降低,与对照组差异极其显著(P<0.01),但对照组中(空白组和空载体组)差异不显著,表明成功敲除小鼠成纤维细胞中的IGF-1R基因。为后人研究IGF-1R基因对蹄叶炎的作用机理提供了技术支持。
本试验通过对采取的蹄叶炎和健康奶牛蹄真皮组织进行转录组测序,并对测序结果进行GO富集分析和KEGG分析,筛选出关于蹄叶炎的差异基因和差异基因富集较多的通路,对选择的差异基因进行原组织的qRT-PCR验证,最终筛选出跟奶牛蹄叶炎相关的目的基因;然后通过NCBI获得目的基因的(鼠源)基因序列,通过网站http://chopchop.cbu.uib.no/设计敲除靶点,本试验借助pSMART-LCKan载体,将设计的敲除靶点连接到lenticrisprv2质粒载体上,并通过凝胶电泳、菌液PCR、测序、酶切鉴定验证是否连接成功,最终得到构建好的特异于小鼠的CRISPR/Cas9敲除表达载体;之后将构建好的特异于小鼠的CRISPR/Cas9敲除表达载体转染至小鼠成纤维细胞中并设置空白组、空载体组进行对照,48h后用嘌呤霉素进行筛选,然后收集细胞通过westernblot比较敲除组和对照组细胞中目的蛋白的表达量。
本试验对挑选出的7个差异基因进行原组织qRT-PCR验证,与胰岛素相关的IGF-1R基因表现出差异极其显著(P<0.01),结果与测序结果倍数差异基本一致,成功筛选出目的基因IGF-1R;在构建CRISPR/Cas9敲除表达载体试验中,凝胶电泳、菌液PCR、测序、酶切鉴定结果与预期结果相符,表明特异于小鼠IGF-1R基因的CRISPR/Cas9敲除表达载体构建成功;通过westernblot比较敲除组(试验组)和对照组(空白组、空载体组)细胞IGF-1R蛋白的表达量,结果显示敲除组IGF-1R蛋白表达量明显降低,与对照组差异极其显著(P<0.01),但对照组中(空白组和空载体组)差异不显著,表明成功敲除小鼠成纤维细胞中的IGF-1R基因。为后人研究IGF-1R基因对蹄叶炎的作用机理提供了技术支持。