【摘 要】
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研究背景胃癌死亡率在全球肿瘤中位居第四位。分子靶向药物曲妥珠单抗可显著延长晚期胃癌（HER2阳性）患者生存期。内质网应激（Endothelial reticulum stress,ERS）与肿瘤耐药密切有关。微小RNA是ERS信号调节通路中重要的内源性基因调节因子。我们团队先前研究已经证实,内质网应激状态下胃癌细胞通过诱导miR-301a-3p的表达调控胃癌对曲妥珠单抗产生耐药,但具体分子机制尚不
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研究背景胃癌死亡率在全球肿瘤中位居第四位。分子靶向药物曲妥珠单抗可显著延长晚期胃癌（HER2阳性）患者生存期。内质网应激（Endothelial reticulum stress,ERS）与肿瘤耐药密切有关。微小RNA是ERS信号调节通路中重要的内源性基因调节因子。我们团队先前研究已经证实,内质网应激状态下胃癌细胞通过诱导miR-301a-3p的表达调控胃癌对曲妥珠单抗产生耐药,但具体分子机制尚不清楚。本课题拟重点探讨,ERS诱导的miR-301a-3p调控胃癌曲妥珠单抗耐药的具体机制。内容和方法1.通过靶基因预测软件TargetScanHuman7.1和miRDB软件系统进行在线靶基因预测分析。2.双荧光素酶报告基因检测验证靶基因LRIG1。3.应用荧光定量 PCR（Quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）和Western Blot检测不同状态胃癌细胞在曲妥珠单抗作用下的LRIG1表达水平。4.ERS状态在NCI-N87或MKN45细胞中分别过表达或抑制miR-301a-3p,使用 Western Blot 检测 LRIG1、GRP78、p-AKT/AKT、p-ERK,以及 ERK 蛋白表达。5.在NCI-N87或MKN45细胞中,分别使用Western Blot检测过表达及抑制 miR-301a-3p 在 TG 和曲妥珠单抗干预下 LRIG1、GRP78、p-AKT、AKT、p-ERK,以及ERK蛋白表达水平。6.使用人酪氨酸激酶磷酸受体阵列在NCI-N87细胞中检测ERS状态下表达改变的酪氨酸激酶磷酸化受体。7.使用Western Blot检测ERS状态NCI-N87或MKN45细胞的IGF-1R和FGFR1表达水平。8.qRT-PCR 检测经 miR-301a-3p/RNAi 与 siLRIG1 共转染后,ERS 状态NCI-N87 或 MKN45 细胞的 IGF-1R 和 FGFR1 mRNA 水平。9.Werstern Blot 检测经 miR-301a-3p/RNAi 与 siLRIG1 共转染后,ERS 状态NCI-N87 或 MKN45细胞的 LRIG1、GRP78、IGF-1R、FGFR1、p-AKT、AKT、p-ERK以及ERK等蛋白表达。10.Western Blot 检测经 miR-301a-3p/RNAi 与 siLRIG1 共转染后,ERS 状态MKN45或NCI-N87细胞在曲妥珠单抗作用下的LRIG1、GRP78、p-AKT/AKT、p-ERK以及ERK蛋白表达。结果1.在线靶基因预测分析提示,LRIG1基因3’-UTR序列与miR-301a-3p存在结合位点。2.双荧光素酶报告基因检测支持靶基因LRIG1,提示miR-301a-3p可以直接作用于LRIG1的3’-UTR,miR-301a-3p对LRIG1具有调控作用。3.在曲妥珠单抗的作用下,MKN45或NCI-N87细胞的LRIG1表达明显上调,而ERS状态MKN45或NCI-N87细胞的LRIG1蛋白表达明显下调。4.抑制 miR-301a-3p 表达后,ERS 状态 MKN45 或 NCI-N87 细胞的 LRIG1蛋白表达明显上调,p-ERK和p-AKT蛋白表达明显下调。5.抑制miR-301a-3p表达后,ERS状态MKN45或NCI-N87细胞在曲妥珠单抗的作用下,LRIG1蛋白表达明显上调,p-ERK和p-AKT蛋白表达明显下调。6.ERS状态NCI-N87或MKN45细胞的IGF-1R和FGFR1表达显著升高。7.miR-301a-3p/RNAi 与 siLRIG1 共转染,ERS 状态 MKN45 或 NCI-N87 细胞中,p-AKT和p-ERK蛋白表达显著上调,IGF-1R和FGFR1的蛋白表达水平显著上调。8.miR-301a-3p/RNAi 与 siLRIG1 共转染,ERS 状态 MKN45 或 NCI-N87 细胞在曲妥珠单抗作用下,p-AKT和p-ERK蛋白表达显著上调,IGF-1R和FGFR1蛋白表达显著上调。结论1.内质网应激诱导的miR-301a-3p通过下调LRIG1的表达,激活AKT以及ERK通路,从而介导胃癌细胞对曲妥珠单抗的耐药。2.内质网应激诱导的miR-301a-3p通过下调LRIG1的表达,上调IGF-1R以及FGFR1的表达,从而介导胃癌细胞对曲妥珠单抗的耐药。
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