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第一部分 麻醉手术引起老龄大鼠海马SIRT1蛋白表达降低、中枢神经炎症反应和tau蛋白表达异常目的:探讨麻醉手术对老龄大鼠海马SIRT1蛋白表达,中枢神经炎症反应和tau蛋白表达的作用。方法:7日龄,14日龄,57日龄,21月龄SD大鼠,取海马组织,蛋白印记杂交(Western Blot)检测四组不同年龄大鼠海马组织中SIRT1蛋白表达的变化(n=6)。21月龄SD雄性大鼠按随机数字表法分为两组:空白对照组(CON组)和麻醉手术组(ISO+SUR组)。麻醉手术组(ISO+SUR组)在2%异氟烷麻醉下行切脾手术,麻醉和手术总时长2 h;空白对照组(CON组)吸入对照气体2 h。麻醉手术结束后24 h,取海马组织,蛋白印记杂交(Western Blot)检测SIRT1,DNMT1,ac-NF-κB,IL-6,ac-tau(k280),ac-tau(k686),p-tau(AT8)蛋白表达(n=6);麻醉手术结束24小时后,灌注多聚甲醛取全脑,免疫荧光IF检测小胶质细胞激活情况。结果:(1)Western Blot结果显示,在四组不同年龄段SD大鼠海马组织中,21月龄大鼠海马SIRT1蛋白表达显著低于7日龄,14日龄,57日龄大鼠海马SIRT1蛋白水平(P<0.05)。(2)在21月龄老龄SD大鼠中,与CON组相比,麻醉手术明显降低了老龄大鼠海马组织中SIRT1,DNMT1蛋白表达水平(P<0.05),升高了ac-NF-κB(P<0.05),IL-6(P<0.001)蛋白水平(P<0.05)。(3)与CON组相比,麻醉手术明显升高了老龄大鼠海马组织ac-tau(k280),ac-tau(k686),ptau(AT8)蛋白水平(P<0.001)。(4)免疫荧光结果显示,与CON组相比,麻醉手术引起了老龄大鼠海马CA1,CA3,DG区小胶质细胞的激活增加。结论:麻醉手术可以引起衰老所致海马SIRT1蛋白表达下降的进一步恶化。麻醉手术可以引起老龄大鼠海马组织DNMT1表达降低,ac-NF-κB,IL-6表达升高,ac-tau(k280),ac-tau(k686),p-tau(AT8)蛋白表达升高,小胶质细胞激活增多,出现海马神经炎症反应。第二部分 SIRT1介导BV2细胞炎症反应性改变及原代神经元tau蛋白表达异常目的:探讨SIRT1在BV2小胶质细胞激活及其对原代神经元损伤中的作用。方法:六孔板培养BV2小胶质细胞,均等浓度培养,将BV2小胶质细胞分为四组:对照组(CON组):0.1%DMSO处理细胞24 h;LPS干预组(LPS组):LPS100 ng/ml+0.1%DMSO处理细胞24 h;白藜芦醇组(RES组):白藜芦醇1μmol+0.1%DMSO处理细胞24 h;白藜芦醇组+LPS组(RES+LPS组):LPS 100 ng/ml+白藜芦醇1μmol+0.1%DMSO处理细胞24 h。细胞干预后收集培养基,进行离心过滤,加入2%B27神经营养因子,20 ng/ml EGF和20 ng/ml FGF-2,标记为条件培养基-80℃保存。细胞干预后提取蛋白,蛋白印记杂交(Western Blot)检测细胞中SIRT1,ac-NF-κB和IL-6蛋白表达(n=6)。出生24h内SD大鼠,取海马皮层组织做原代神经元培养。六孔板培养原代神经元,均等浓度培养,将原代神经元分为四组:对照培养基组(CON CM组):对照组BV2小胶质细胞条件培养基处理原代神经元24 h;LPS处理条件培养基组(LPS CM组):LPS组BV2小胶质细胞条件培养基处理原代神经24 h;白藜芦醇处理条件培养基组(RES CM组):白藜芦醇组BV2小胶质细胞条件培养基处理原代神经元24 h;白藜芦醇+LPS处理条件培养基组(RES+LPS CM组):LPS+白藜芦醇组BV2小胶质细胞条件培养基处理原代神经元24 h。原代神经元干预后提取细胞蛋白,蛋白印记杂交(Western Blot)检测细胞中SIRT1,ac-tau(k280),ac-tau(k686)和p-tau(AT8)蛋白表达(n=6)。结果:(1)在BV2小胶质细胞中,Western Blot结果显示,与CON组相比,LPS会引起BV2小胶质细胞SIRT1表达减少(P<0.001),ac-NF-κB和IL-6蛋白表达升高(P<0.001);与LPS组相比,RES+LPS组的SIRT1表达升高(P<0.05),ac-NF-κB(P<0.05)和IL-6(P<0.001)蛋白表达降低。(2)在原代神经元中,Western Blot结果显示,与CON CM组相比,LPS CM组的SIRT1表达降低,actau(k280),ac-tau(k686)和p-tau(AT8)蛋白表达升高(P<0.05);与LPS CM组相比,RES+LPS CM组细胞SIRT1表达升高(P<0.001),ac-tau(k280),actau(k686)和p-tau(AT8)蛋白表达降低(P<0.05)。结论:LPS会引起BV2小胶质细胞SIRT1表达下调并出现炎症反应,BV2小胶质细胞发生炎症反应会引起原代神经元乙酰化tau蛋白和磷酸化tau蛋白表达升高,反应了神经元功能受损。给与白藜芦醇干预的BV2小胶质细胞可以缓解LPS所致SIRT1表达下调并及炎症反应,并进一步缓解出现炎症反应的BV2小胶质细胞所致原代神经元乙酰化tau蛋白和磷酸化tau蛋白表达升高,保护了神经元功能。第三部分 SIRT1介导麻醉手术致老龄大鼠海马神经炎症反应、tau蛋白表达异常和认知功能损害目的:探讨SIRT1在麻醉手术致老龄大鼠海马神经炎症反应、tau蛋白表达及术后认知功能损害中的作用。方法:实验一:21月龄雄性老龄SD大鼠,体重620~670 g,按照按随机数字表法分为四组:对照组(CON组):于吸入对照气体12 h前给与连续7 d腹腔注射DMSO生理盐水混合剂1 ml,吸入对照气体2 h;麻醉手术组(ISO+SUR组):于麻醉手术12 h前给与连续7 d腹腔注射DMSO生理盐水混合剂1 ml,2%异氟烷麻醉下行切脾手术,麻醉和手术总时长2 h;白藜芦醇组(RES组):于吸入对照气体12 h前给与连续7 d腹腔注射白藜芦醇10 mg/kg,吸入对照气体2 h;白藜芦醇+麻醉手术组(RES+ISO+SUR组):于吸入对照气体12 h前给与连续7 d腹腔注射白藜芦醇10 mg/kg,2%异氟烷麻醉下行切脾手术,麻醉和手术总时长2 h。麻醉手术结束后24小时,取海马组织,蛋白印记杂交(Western Blot)检测SIRT1,DNMT1,ac-NF-κB,IL-6蛋白表达(n=6),ELISA检测TNF-α和IL-1β表达(n=6),PCR检测CD86m RNA,CD206 m RNA和SOCS3 m RNA表达(n=6);麻醉手术结束24小时后,灌注多聚甲醛取全脑,免疫荧光IF检测小胶质细胞激活情况;麻醉手术结束24小时后,取海马组织,蛋白印记杂交(Western Blot)检测ac-tau(k280),ac-tau(k686),p-tau(AT8)蛋白的表达。实验二:21月龄雄性老龄SD大鼠,体重620~670 g,按照按随机数字表法分为四组:对照组(CON组):于吸入对照气体12 h前给与连续7 d腹腔注射DMSO生理盐水混合剂1 ml,吸入对照气体2 h;麻醉手术组(ISO+SUR组):于麻醉手术12 h前给与连续7 d腹腔注射DMSO生理盐水混合剂1 ml,2%异氟烷麻醉下行切脾手术,麻醉和手术总时长2 h;白藜芦醇组(RES组):于吸入对照气体12 h前给与连续7 d腹腔注射白藜芦醇10 mg/kg,吸入对照气体2 h;白藜芦醇+麻醉手术组(RES+ISO+SUR组):于吸入对照气体12 h前给与连续7 d腹腔注射白藜芦醇10 mg/kg,2%异氟烷麻醉下行切脾手术,麻醉和手术总时长2 h。麻醉手术结束第12-13天,进行条件恐惧实验评估联想学习记忆功能(n=10),麻醉手术结束第15-20天,进行水迷宫实验评估空间学习记忆功能(n=10)。结果:(1)Western Blot结果显示,与对照组相比,麻醉手术组海马组织SIRT1,DNMT1蛋白表达降低,ac-NF-κB,IL-6蛋白表达升高;与麻醉手术组相比,白藜芦醇+麻醉手术组海马组织SIRT1,DNMT1蛋白表达升高(P<0.05),ac-NF-κB(P<0.05),IL-6(P<0.001)蛋白表达降低;(2)免疫荧光结果显示,与对照组相比,麻醉手术组海马CA1,CA3,DG区小胶质细胞的激活增加;与麻醉手术组相比,白藜芦醇+麻醉手术组海马CA1,CA3,DG区小胶质细胞的激活减少;(3)PCR结果表明,与对照组相比,麻醉手术组老龄大鼠海马的细胞毒性M1型小胶质细胞标记物CD86 m RNA和免疫调节M2b型小胶质细胞标记物SOCS3m RNA表达升高(P<0.001),而修复/再生M2a型小胶质细胞标记物CD206m RNA的表达降低(P<0.001);与麻醉手术组相比,白藜芦醇+麻醉手术组老龄大鼠海马的M1型小胶质细胞标记物CD86 m RNA和M2b型小胶质细胞标记物SOCS3 m RNA表达降低(P<0.001),而M2a型小胶质细胞标记物CD206m RNA的表达升高(P<0.001);(4)ELISA结果表明,与对照组相比,麻醉手术组海马的TNF-α和IL-1β蛋白表达升高(P<0.001);与麻醉手术组相比,白藜芦醇+麻醉手术组老龄大鼠的海马TNF-α和IL-1β蛋白表达降低(P<0.001)。(5)条件恐惧实验结果显示,与对照组相比,麻醉手术组大鼠在情境条件恐惧中的僵直时间缩短(P<0.05);与麻醉手术组相比,白藜芦醇+麻醉手术组大鼠在情境条件恐惧中的僵直时间变长(P<0.05)。水迷宫结果显示,与对照组相比,麻醉手术组大鼠在训练第5天的逃避潜伏时间变长(P<0.001),在探索实验中目的象限停留时间和穿越平台次数均减少(P<0.05)。与麻醉手术组相比,白藜芦醇+麻醉手术组大鼠在训练第5天的逃避潜伏时间减短(P<0.05),在探索实验中目的象限停留时间和穿越平台次数均升高(P<0.05)。(6)Western Blot结果显示,与对照组相比,麻醉手术组海马组织的ac-tau(k280),ac-tau(k686),p-tau(AT8)蛋白表达均上升(P<0.001);与麻醉手术组相比,白藜芦醇+麻醉手术组海马组织的ac-tau(k280),ac-tau(k686),p-tau(AT8)蛋白表达均降低(P<0.05)。结论:麻醉手术可以引起老龄大鼠海马小胶质细胞激活增强,具有神经毒性的小胶质细胞表型升高,海马中中枢神经炎症反应因子表达升高,引起老龄大鼠认知功能障碍。给与SIRT1激动剂白藜芦醇预处理后,可以改善麻醉手术所致老龄大鼠海马炎症反应,降低中枢神经炎症反应因子,改善老龄大鼠术后联想学习记忆功能和空间学习记忆功能受损。