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2015版《中国药典》中记载苍术基原物种为北苍术Atractylodes chinensis(DC.)Koidz和茅苍术Atractylodes lancea(Thunb.)DC.。北苍术、茅苍术和关苍术在最新《中国植物志》中统称为苍术,是菊科苍术属多年生草本植物。近年来由于市场供不应求等原因,导致市场中存在很多苍术混伪品,这使得含苍术中成药存在巨大安全隐患。中成药中原料药材的鉴定一直是人们关注的焦点。宏条形码技术可以对混合样品进行测序,鉴定标准统一,灵敏度高,相较于传统方法,可以更加准确、便捷地鉴定中成药原料药材的基原。目的:本研究选择中成药中的苍术为研究对象,从原产地收集苍术及其混伪品,通过构建苍术及其混伪品DNA条形码参考数据库,优化含苍术中成药的DNA提取方法,运用基于PCR-free的以物种遗传信息为鉴定依据的宏条形码技术对中成药二妙丸中苍术成分进行分子鉴定,探讨宏条形码技术对中成药原料药材鉴定的可行性,为中成药的原料药材的基原鉴定提供新方法。方法:1.收集苍术及其混伪品获得ITS2、mat K和rbc L序列。基于BLAST比对和NJ系统发育树进行物种鉴定。另从Genbank中下载29条序列以补充数据库,与所得标准序列一起用于构建苍术及其混伪品DNA条形码参考数据库。2.探究不同裂解次数、不同纯化方法和不同裂解液对DNA质量的影响。对《中国药典》中收录的含苍术中成药进行系统整理,根据含苍术中成药的DNA质量、剂型、苍术的入药方式等因素对含苍术中成药进行筛选,选择具有代表性实验对象。3.从线下药店购买二妙丸中成药中的原料药材炒苍术、炒黄柏和用来验证宏条形码技术的灵敏性的西洋参各一份,运用DNA条形码技术进行鉴定,确保基原准确。4.参考《中国药典》上规定的制法,制作实验对照样品2份,其中一份加入西洋参。之后对3盒二妙丸市售样品和2份二妙丸实验对照样品进行DNA提取,对提取质量合格的DNA进行高通量测序,数据分析后得到的序列,通过第一部分构建的苍术及其混伪品DNA条形码参考数据库对所得序列进行比对,分析中成药中是否存在苍术混伪品或常见近源物种。结果:1.苍术标准品及其混伪品的DNA质量良好且稳定,采用ITS2、rbc L和mat K通用引物扩增的PCR产物进行凝胶电泳均可以获得明亮、单一的条带,表明扩增成功率为100%。出现明亮、单一条带的PCR产物共9份进行双向测序,经过序列拼接共得到9条序列,测序成功率为100%。对所得序列进行数据分析共得到3条ITS2序列、3条rbc L序列和3条mat K序列,与Genbank中下载29条序列一起构建NJ系统发育树。基于ITS2序列的NJ系统发育树中苍术和白术呈现良好的单系性,可以有效区分。而基于rbc L序列和mat K序列的NJ系统发育树分支混乱,序列差异极小,不能区分白术和苍术。2.通过不同裂解次数、不同纯化方法和不同裂解液对DNA质量的影响的实验得出,使用GP1裂解液1次裂解,GD、PW过柱纯化为最优实验步骤。对收集12种含苍术中成药进行DNA提取,其中二妙丸DNA浓度最高,质量最优,选择二妙丸作为代表性研究对象进行后续宏条形码技术鉴定研究。3.将炒黄柏和西洋参ITS2序列输入中药材DNA条形码鉴定系统进行BLAST比对(网址:http://www.tcmbarcode.cn),结果得出,炒黄柏基原为黄皮树(Phellodendron chinense Schneid.),西洋参基原为西洋参(Panax quinquefolium L.)。炒苍术ITS2序列与第一部分所得苍术及其混伪品DNA条形码参考数据库进行比对和NJ系统发育树构建,结果显示炒苍术ITS2序列与苍术聚为一支,表明炒苍术基原为苍术(Atractylodes lancea(Thunb.)DC.)。上述三种药材均为正品。4.二妙丸3个商业样品和2个自制对照样品中均可以检测到正品苍术(Atractylodes lancea(Thunb.)DC.),但同时在A36和EMW8中发现了苍术的混伪品白术(Atractylodes macrocephala Koidz.);除此之外A60中发现了甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)、黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)、芍药(Paeonia lactiflora Pall.)、地榆(Sanguisorba officinalis L.)等处方中未标注中药;EMW8中发现了何首乌(Fallopia multiflora(Thunb.)Harald.);5份样品中均发现了霉菌、真菌和少量小麦(Triticum aestivum L.)、黑麦(Secale cereale L.)、豇豆(Vigna unguiculata(L.)Walp.)、缬草(Valeriana officinalis L.)等非《中国药典》物种序列。结论:通过对苍术及其混伪品样品的收集、DNA提取和序列分析,使用DNA条形码技术可以对苍术及其混伪品样品进行准确鉴定,成功构建苍术及其混伪品DNA条形码参考数据库。运用基于PCR-free的宏条形码技术对代表性含苍术中成药二妙丸进行鉴定,可以准确、有效地鉴定中成药中苍术原料药材的基原,为中成药的原料药材的基原鉴定提供了新方法。