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研究背景和研究目的膀胱肿瘤是泌尿男生殖系最常见的肿瘤。最新的流行病学研究调查表明膀胱肿瘤是全球最常见的肿瘤之一,其中在发达国家呈现下降趋势。而根据我国的流行病学调查,发病率为7.49/10万,在所有恶性肿瘤的发病率中排第七位,占发病总数的2.5%,同时,我国的膀胱癌治疗已取得长足进步,但与发达国家相比仍存在一定差距。根据病理学的分型,绝大多数的膀胱肿瘤均属于膀胱尿路上皮癌,而在临床上,尤其以高级别肌层浸润性膀胱癌(MIBC,包括T2以上)为代表,具有着恶性程度高、容易发生转移、进展迅速的特点。做为小分子家族的一类,趋化因子的作用主要是通过与G蛋白偶联受体结合来实现的。在肿瘤的发生发展过程中,不同的趋化因子特异性的与肿瘤细胞表面的受体相结合,从而实现对肿瘤细胞的特定趋化,从而完成肿瘤的远处转移和浸润,我们不难看出,趋化因子及其受体在癌症治疗尤其是肿瘤浸润中的关键作用。其中,CCR4作为一种重要的趋化因子受体,在多种肿瘤细胞和免疫细胞中均有表达,据文献报道,CCR4在胃癌、乳腺癌、肺癌等血液系统恶性肿瘤或实体肿瘤中发挥着重要作用,其中CCR4可能与CCL17/CCL22诱导的肿瘤细胞迁移有关。然而,现有研究对于CCR4在膀胱癌的发生发展中的作用却知之甚少。因此,本研究的目的是探究膀胱癌组织中CCR4的表达,其与多种临床病理因素的相关性以及CCL17-CCR4在细胞侵袭转移中的作用,并探究其分子机制。研究方法通过Western Blot检测CCR4在膀胱癌和相应癌旁组织中的表达,利用免疫组织化学染色方法(IHC)探究CCR4在膀胱癌组织中的表达,并对122例标本的染色结果进行评分,通过Kaplan-Meier曲线分析无复发生存率,并通过Cox风险回归分析进行单因素和多因素分析。通过Western Blot、PCR和细胞免疫荧光技术检测CCR4在膀胱癌细胞系T24和253J上的表达。随后通过细胞划痕实验和Transwell实验检测CCL17对膀胱癌细胞的侵袭迁移能力的影响。利用质粒构建稳定的CCR4低表达细胞株,并检测其与对照组之间迁移能力的差别,同时利用Western Blot实验检测相关通路的蛋白表达情况。利用ERK通路抑制剂U0126,进一步探究ERK-MMP13通路与CCL17-CCR4的关系,并通过细胞划痕和Transwell实验检测U0126作用下,膀胱癌细胞的相应变化。研究结果Western Blot结果显示,CCR4在膀胱癌组织中的蛋白表达量总体高于癌旁组织,同时,IHC结果显示,在122例标本中,CCR4高表达的有68例,占55.7%,Kaplan-Meier曲线统计分析发现CCR4表达量的高低与OS有显著相关性(P=0.002),此外,多因素Cox风险回归分析显示CCR4表达量为独立预后因素(P=0.007)。为了检测CCR4在膀胱癌细胞上的表达情况,我们分别用Western Blot、RT-qPCR和细胞免疫荧光技术,结果显示CCR4在膀胱癌细胞系T24和253J细胞中均有明显表达。随后,当在细胞上清中添加人工合成CCL17趋化因子后,T24和253J细胞均出现了侵袭迁移能力增强的情况,同时Western Blot也显示细胞中的CCR4表达量升高,表明CCL17可以促进CCR4的表达。为了探究CCR4在上述过程中的作用,我们利用质粒稳转构建了低表达CCR4的膀胱癌细胞系(sh-T24和sh-253J),在同等剂量的CCL17作用下,低表达膀胱癌细胞系的侵袭迁移能力出现显著下降。而为了探究其相关的分子机制,我们进行了Western Blot实验,发现CCR4低表达的膀胱癌细胞系中P-ERK和MMP13的表达也随之下降。通过添加ERK通路抑制剂U0126,我们发现T24和253J的侵袭迁移能力出现了明显的下降,并且在添加了CCL17后并未出现明显的恢复,进一步表明CCL17-CCR4对膀胱癌细胞的调控是通过ERK-MMP13信号通路实现的。研究结论本研究证实了CCR4的表达与膀胱癌患者的临床预后之间的相关性,同时CCL17-CCR4可通过ERK-MMP13信号通路影响膀胱癌细胞的侵袭迁移能力。因此,CCR4可以作为治疗膀胱癌的潜在靶点,具有更深入的研究价值。