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一定数量的卵泡是维持卵巢功能的基础,卵巢组织冻存移植的目标在于不断改进冻存移植技术,使移植后获得尽可能多的存活卵泡,更利于移植后卵巢组织功能的恢复及长期维持。已有研究显示,小皮质片的冻存后移植,远期功能维持还不理想。故本研究目的是通过对卵巢大皮质块的玻璃化冻存条件的优化研究,探索可保存大量原始卵泡的简便、经济、有效的卵巢组织冻存法;通过添加促性腺激素对卵巢进行冷冻和移植前的干预,以诱导卵巢组织和受体移植部位VEGF表达的增强,减少移植物的缺血缺氧损伤,最大限度地防止卵泡丢失。为移植卵巢功能的正常维持提供科学依据,为增强临床的实用性和可行性提供技术方法。方法1.不同体积的绵羊卵巢皮质块冻存最佳玻璃化渗透平衡时间的研究:将2～6月龄的绵羊卵巢皮质按体积的不同分为三组,小体积组:5mm×4mm×2mm(40mm3);中体积组:10mm×4mm×2mm(80mm3);大体积组:10mm×8mm×2mm(160 mm3)大小的组织块,采用两步渗透平衡法摸索适宜于不同体积的绵羊卵巢组织的玻璃化冷冻的渗透平衡时间,并对解冻后的卵巢进行普通光学显微镜、及凋亡相关的免疫组织化学检测。2. FSH对新鲜及解冻后培养的卵巢组织VEGF表达及卵泡发育影响的研究:在培养液中添加FSH,应用免疫组织化学法检测培养24h、48h的卵巢组织VEGF表达及观察培养6d卵泡直径的变化。3.小鼠卵巢器官不同部位移植对卵泡存活的影响的研究:将移植小鼠随机分为肾被膜下、颈部皮下、腹腔内及下肢根部肌肉肉芽肿内四组,移植168h后通过组织学观察存活卵泡数比较不同部位移植效果。4.新鲜及玻璃化冻融绵羊卵巢组织异种移植的实验研究:各组绵羊卵巢组织行裸鼠颈部皮下移植,通过血清FSH测定、移植存活卵泡数评价FSH对大皮质卵巢组织移植的作用。结果1.三种不同体积的卵巢皮质块在玻璃化冷冻液中经适宜的渗透平衡后,进行玻璃化冻存。( 1)小体积(40mm3)皮质块在玻璃化液渗透平衡不同时间下冷冻后,卵巢组织内形态正常卵泡百分率以渗透平衡7min组(86.61±5.37)与新鲜对照组(88.30±4.71)相似外,5min、6min、8min组与新鲜对照组相比,差异有统计学意义,P<0.05;中体积(80mm3)皮质块在不同渗透平衡时间下冷冻后卵巢组织内形态正常卵泡数除渗透平衡13min组较低外,10min、11min、12min组与新鲜对照组(88.76±5.05)相比,差异无统计学意义,P>0.05;以11min组(88.33±3.95)与新鲜对照组最接近。渗透平衡各组间相互比较,13min组(84.35±5.45)与11min组差异有统计学意义,P<0.05;大体积(160mm3)皮质块在不同渗透平衡时间下冷冻后卵巢组织内形态正常卵泡除渗透平衡20min组较低外, 17min、18min、19min组与新鲜对照组( 87.24±3.40)相比,差异无统计学意义,P>0.05,以19min组(86.53±4.11)与新鲜对照组最接近。渗透平衡各组间相互比较,20min组(83.13±4.72)与19min组差异有统计学意义,P<0.05。(2)冷冻前后TUNEL阳性卵泡的观察:新鲜组及冻融组均可观察到卵泡发生凋亡,与冷冻前相比,冷冻后卵巢中卵泡发生凋亡的比例显著增加,差异有统计学意义,P<0.05。2.对上述结果进行分析研究,提出在22～24℃室温下,当厚度为2mm时,计算已知表面积S(mm2)卵巢大皮质块的玻璃化渗透平衡时间T(min)的数学模式为T=(S+15)/5。3.卵泡刺激素(FSH)可使培养6天的新鲜及玻璃化冻融卵巢卵泡发育,卵泡直径较未培养组显著增大,差异有统计学意义,P<0.05。培养24h与48h均表现为添加FSH的新鲜组与玻璃化冻融组VEGF表达增高,与非FSH干预组相比差异具有统计学意义,P<0.05,尤其是新鲜卵巢培养组VEGF阳性表达最高。对冻融组中卵巢组织培养6天培养液进行E2测定,同样显示添加FSH组E2水平高于未添加组,差异有统计学意义,P<0.05。4.小鼠卵巢器官不同部位移植168h各移植组移植物存活率及卵泡数比较:腹腔移植组存活卵泡数最少与其余各组相比差异均具统计学意义,其余三个部位移植组卵泡存活数无显著性差异,其中以肾被膜下移植组存活卵泡数与正常对照最接近。5.新鲜及冻融羊卵巢组织大皮质块裸鼠颈部皮下移植的实验研究结果表明血清FSH去势对照组(ACG)最高,与其余各移植组差异有统计学意义,P<0.05;移植6周组织学显示新鲜移植组卵泡数最多,冻融移植组卵泡数显著低于新鲜组,而冻融+FSH移植组(VTFG)的卵泡数(235.57±94.51)明显高于冻融组(30.4±20.67)(VFG)。结论1.超速玻璃化法可有效冻存体积为40mm3、80mm3及160mm3绵羊卵巢组织大皮质块。在22～24℃条件下,当厚度为2mm时,计算已知表面积S(mm2)卵巢大皮质块的玻璃化渗透平衡时间T(min)的数学模式为T=(S+15)/5。2.培养液中添加10μg/mL FSH,可增加新鲜和冻融卵巢组织中VEGF的表达,并促进卵泡的发育。3.玻璃化液、解冻液和培养液中添加10μg/mL FSH,可提高玻璃化冻存绵羊卵巢组织裸鼠体内移植的存活卵泡数量。