前言：　　 日光紫外线(ultra violetradiation,UV)照射可引起急性损伤如日晒伤和慢性累积性损伤如皮肤癌及光老化。日光中紫外线诱导的DNA损伤是导致皮肤癌发生的一个重要因素,同时在皮肤癌细胞中发现,调控细胞增殖、分化和凋亡的特异性基因出现与紫外线损伤相关的变异。根据日光中紫外线波长的不同,可将其分为3种:UVA,UVB和UVC,造成生物损害的紫外线主要是波长短,能量较高的UVB(波长290-320nm),是导致DNA损伤的主要类型。目前已证实一些原癌基因和抑癌基因由于紫外线引起的DNA损伤而发生变异。UV诱导产生皮肤癌是一个复杂的过程,涉及到许多细胞和分子水平上的变化,同时还与DNA的修复作用相关。　　 肿瘤的发生、发展及远处转移是一个复杂的过程,事实上,恶性增生多数是由多种因素和多条信号转导通路失调促成的。磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)是体内的能量调节器,AMPK激活后可促进葡萄糖重吸收、糖酵解和脂肪酸氧化,减少脂肪酸、胆固醇和蛋白质的合成,储存能量,被称为“细胞能量调节器”,近年来关于该通路在肿瘤的发生发展中的作用研究很多,发现其在多种肿瘤中表达缺失。AICAR和metformin是目前研究最多的AMPK通路激活剂,本文通过体外细胞实验及构建SKH-1无毛小鼠紫外线致皮肤癌模型研究该药物对紫外线辐射诱导皮肤癌的预防和治疗作用,并阐明其机制。　　 目的：　　 本实验拟观察AICAR和metformin处理的正常人上皮角化细胞(normalhumanepidermalkeratinocytes,NHEK)及AMPKwide-type(WT)和AMPKknockdown(KD)鼠胚胎成纤维细胞(mouseembryonicfibroblast,MEF),经过紫外线(主要是UVB)辐射后AMPK通路相关分子改变,及DNA损伤修复改变,并通过构建紫外线致SKH-1无毛小鼠皮肤癌模型研究这两种药物对紫外线辐射诱导皮肤癌的预防和治疗作用,并探讨其作用机制。　　 材料与方法：　　 1、常规培养的MEF细胞WT和KO,加或不加AICAR及metformin处理24,48,72h后,MTS方法检测细胞存活曲线。　　 2、常规培养的MEF细胞,WT和KD,照射UVB(10焦耳),后0,6,24,48h提取DNA;常规培养的MEF细胞WT和KD分别加或不加AICAR及metformin培养24h后,照射UVB(10焦耳),后0,6,24h提取DNA;SKH-1无毛小鼠,UVB照射前1h,后背涂或不涂丙酮配置的AICAR和metformin溶液,进行单次UVB照射后处死小鼠,剥离皮肤提取DNA;SlotBlot方法检测UVB照射后不同时间DNA片段CPD及6-4PP修复情况。　　 3、动物实验:动物培养遵守芝加哥大学动物保护和使用机构条例,分为2部分,第一部分,预防辐射致皮肤癌模型:SKH-1无毛小鼠,分为4组,对照组,单纯照射组,AICAR(1umol)处理组,Metformin(2umol)处理组,每周UVB照射(100mJ/cm2)三次,连续25周,实验组小鼠每次照射前后背照射区域皮肤涂AICAR或metformin。每周记录小鼠体重变化及皮肤变化,记录肿瘤发生时间,及肿瘤数目。第二部分,辐射致皮肤癌治疗模型:SKH-1无毛小鼠,每周UVB照射(100mJ/cm2)三次,至17周,按照生成肿瘤大小及数目随机分为单纯照射组,metformin涂药治疗组,metformin灌胃治疗组,继续照射,每日照射前进行相应处理。继续每周记录肿瘤数目,大小变化。　　 4、提取细胞蛋白,小鼠后背皮肤蛋白,采用Westernblot法检测ERK通路相关分子变化及DNA修复相关蛋白变化。　　 5、HE染色观察照射后各组小鼠皮肤上皮增生增厚情况。　　 6、免疫组化方法检测照射后小鼠正常皮肤及肿瘤组织增殖因子Ki67表达情况。　　 7、采用Prism5(GraphPadsoftware,SanDiego,CA)统计软件分析,所有数据用3次独立实验的均值±标准误表示,采用t检验及方差分析,P＜0.05为有统计学意义。　　 结果：　　 1、为了证实AMPK信号通路在皮肤癌发生发展中的作用,我们用WesternBlot检测了P-AMPK,P-ACC,ACC在正常人皮肤上皮细胞,人皮肤癌细胞,紫外线诱导小鼠皮肤癌细胞,及紫外线照射后0.5,6,24h正常小鼠皮肤、未照射小鼠皮肤中的表达,我们发现AMPK信号通路在皮肤肿瘤中被抑制,紫外线照射短时间内0.5和6h时被激活,24h后被抑制。　　 2、激活AMPK通路抑制紫外线诱导的小鼠皮肤肿瘤形成。我们用AMPK信号通路激活剂AICAR及metformin处理SKH-1无毛小鼠,westernBlot结果显示P-ACC表达增加,AICAR和metformin激活小鼠皮肤AMPK通路;应用AICAR及metformin的紫外线照射组与单纯紫外线照射相比,用药组延迟紫外线诱导小鼠皮肤癌发生时间,减少肿瘤生成个数及大小。　　 3、AICAR和metformin通过AMPK通路增加UVB导致的DNA损伤后修复。在WT和KO的MEF细胞经过UVB照射后的slotblot结果显示,AMPK缺失的MEF细胞显著减少了CPD片段修复,但是对6-4PP修复无明显影响(P＜0.05,Studentst-testandtwo-wayANOVA);在AICAR和metrormin预处理的小鼠皮肤,紫外线照射后,6小时CPD修复增加,但是24小时的CPD及6-4PP修复未见改变。AICAR和metformin处理的MEF细胞,紫外线照射后,AMPK-WT细胞CPD修复效率提高,但对AMPK-KO细胞无影响。另外,分子水平通过WesternBlot检测,我们发现AMPK缺失的MEF细胞,XPC表达明显减少,同时,AICAR和metformin增加NHEK细胞的XPC表达。　　 4、AICAR和metformin抑制细胞增殖不依赖于AMPK通路。我们观察HE染色的对照组小鼠,AICAR和metformin处理的不同组小鼠上皮增生情况,发现慢性紫外线照射使小鼠皮肤上皮层厚度增加约10倍,而AICAR和metformin处理组小鼠的上皮增生程度明显减少;免疫组化检测增殖因子Ki67,我们发现AICAR和metformin处理组小鼠皮肤上皮层Ki67阳性细胞较对照组明显减少(P＜0.05,Studentst-test)。这些数据表明AICAR和metformin抑制细胞增殖。为了验证AMPK信号通路与该抑制作用的关系,我们研究AICAR和metformin作用于AMPK-WT和KO的MEF细胞,发现AMPK缺失的MEF细胞在48、72h显著增加细胞增殖,AICAR和metformin对WT和KO的MEF细胞都有抑制作用,提示我们AMPK通路对于控制细胞增殖有重要作用,但是AICAR和metformin的抑制增殖作用不依赖于AMPK通路。　　 5、我们通过研究mTOR和ERK通路探索AICAR和metformin抑制细胞增殖的机制。WesternBlot结果发现,在AICAR和metformin处理后的小鼠皮肤,ERK表达明显降低,但是mTOR通路下游4EBP1表达无明显改变;AMPK缺失的MEF细胞,ERK和其上游EGFR表达均明显增高,4EBP1表达仍无明显差异,在AMPK-KO细胞,抑制EGFR表达,减少ERK磷酸化和CyclinD1水平,抑制ERK也降低CVclinD1水平。同样AICAR和metformin降低NHEK细胞的ERK活性。这些数据显示AMPK是EGFR/ERK/CyclinD1通路抑制剂。然而,AICAR和metformin不但降低AMPK-WT细胞ERK活性,同时降低AMPK-KO细胞ERK活性,说明其对ERK通路抑制不是通过AMPK通路,相反,AICAR和metformin对WT和KO细胞的EGFR磷酸化均没有影响,提示我们AICAR和metformin的作用为EGFR下游ERK上游之间的一个靶点。　　 6、在慢性UVB诱导的小鼠皮肤癌模型,至17周时,每只小鼠约发生3-4个肿瘤,直径平均约2-4mm,随机分为空白对照组,metformin外涂(Met-T),metformin口服灌胃(Met-G),结果显示应用metformin的两组小鼠均减少了新肿瘤形成,且和对照组相比明显抑制已形成肿瘤的生长,口服灌胃组治疗效果更明显(P＜0.05.Smdentst-test)。WesternBlot结果显示在Met-T和Met-G组小鼠照射区正常皮肤均增加ACC磷酸化,激活AMPK通路;HE染色发现Met-T和Met-G组小鼠照射区非肿瘤部分皮肤增生较对照组明显减少;免疫组化结果显示Met-T和Met-G组增殖因子Ki67阳性细胞较对照组明显减少。　　 讨论：　　 近年来关于磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)-细胞能量调节器的研究很多,研究表明激活AMPK信号通路对肿瘤生长和存活有抑制作用,该通路激活剂AICAR及经典降糖药物metformin可以通过激活AMPK增强其抗肿瘤作用。但是AICAR和metformin是否能调节正常细胞基因组的完整性及其作用机制未见研究,本实验研究结果表明,AMPK通路在人皮肤肿瘤及紫外线(UVB)诱导小鼠皮肤肿瘤中表达降低。动物实验结果表明,表皮涂抹AMPK激活剂AICAR或metformin可以减少紫外线诱导小鼠皮肤肿瘤形成,在紫外线诱导小鼠肿瘤模型中,表皮涂抹或者口服metformin可以减少新的肿瘤形成并且抑制已形成肿瘤的生长。机制研究表明,AICAR和metformin可以通过AMPK信号通路促进紫外线导致的DNA损伤修复,然而他们却未依赖于AMPK通路抑制细胞增殖。我们本实验结果显示AICAR和metformin可以通过促进正常皮肤细胞在受到紫外线照射损伤后的DNA修复,降低因DNA损伤变异发生肿瘤的几率。　　 首先,我们的研究结果显示了能量代谢和基因组稳定性的关系,在紫外线诱导的DNA损伤修复中需要AMPK参与。我们通过以下几个方面的证据来验证该结论:(1)AICAR和metformin促进紫外线诱导的小鼠皮肤DNA损伤修复。(2)AMPK缺失的MEF细胞DNA损伤修复被抑制。(3)在AMPK缺失的MEF细胞,AICAR和metformin促进DNA损伤修复作用消失。分子水平机制研究中我们发现,核苷酸切除修复(GG-NER)的关键蛋白XPC,在AMPK缺失的MEF表达中明显降低,而AICAR和metformin能够增加该蛋白的表达,但是关于AMPK如何调控XPC的机制需要进一步研究。已有研究证实环丁烷嘧啶二聚体(CyclobutanePyrimidineDimer,CPD)是紫外线对DNA损伤导致皮肤癌的首要环节,而我们的研究显示,AMPK通路激活对增强核苷酸外切修复(GG-NER)能力具有重要意义,通过GG-NER修复CPD,从而减少皮肤癌发生。　　 另一方面,我们的研究结果显示AICAR和metformin抑制小鼠皮肤上皮细胞增殖,减少紫外线导致的上皮增生。AMPK通过抑制有丝分裂EGFR/ERK通路抑制细胞增殖,相反,AICAR和metformin均抑制ERK通路但是对EGFR表达无明显影响。AICAR和metformin抑制细胞增殖及对ERK通路的抑制不依赖于AMPK通路,因为我们的研究结果发现在AMPK缺失的MEF细胞,AICAR和metformin的细胞生存抑制作用及ERK通路的抑制作用仍然存在。但是有趣的是,前人的关于AICAR/AMPK和ERK通路的研究结果与我们的研究结果正好相反。在胚胎成纤维细胞(NIH-3T3)和心肌纤维细胞,AICAR抑制生长因子诱导的ERK通路激活,这个作用是通过AMPK通路但是与EGFR表达无关;相反在白血病K562细胞,ERK激活需要AMPK,所以我们总结AICAR调节ERK通路的作用是细胞特异性的,与细胞系有关。我们的研究结果显示,在皮肤细胞及小鼠成纤维细胞(MEF),AICAR和metformin抑制ERK通路既不依赖于AMPK通路也不依赖于EGFR通路。另外,虽然已有研究结果表明AMPK和metformin抑制mTOR通路,但是我们的研究结果发现,在小鼠皮肤细胞和小鼠成纤维细胞系MEF,AICAR和metformin并没有影响mTOR信号通路活动。实际上,一个关于胶质母细胞瘤的研究结果显示,尽管AICAR没有像mTOR信号通路抑制剂雷帕霉素那样明显抑制mTOR信号通路,但是它对该细胞的生长抑制作用却比雷帕霉素强,这一结果无疑是对mTOR信号通路抑制作用的一个挑战。下一步,我们将继续研究AICAR和metformin对ERK通路抑制及控制增殖的分子机制,进一步阐明mTOR在AICAR和metformin治疗肿瘤作用中的作用机制。　　 总之,我们的实验结果表明,AMPK激活剂AICAR和metformin可以抑制紫外线诱导的皮肤肿瘤,他们通过激活AMPK通路促进紫外线诱导的DNA损伤修复,但是他们通过抑制ERK通路抑制细胞增殖作用是非AMPK通路依赖的。我们的研究结果显示,AICAR和广泛应用的抗代谢药物metformin对紫外线辐射诱导皮肤肿瘤具有潜在的化学预防作用,尤其是对于有皮肤癌病史的患者更有价值。　　 结论：　　 1、AMPK信号通路在人皮肤鳞癌细胞和慢性紫外线照射诱导的小鼠皮肤肿瘤中被抑制。　　 2、激活AMPK信号通路抑制紫外线诱导的SKH-1无毛小鼠肿瘤生成。　　 3、AICAR和metformin通过激活AMPK信号通路增加紫外线诱导的DNA损伤修复。　　 4、AICAR和metformin抑制细胞增殖是AMPK信号通路非依赖性的。　　 5、AICAR和metformin抑制MEF细胞及皮肤肿瘤中ERK信号通路。　　 6、在慢性紫外线照射诱导小鼠肿瘤模型中,metformin可以减少新的肿瘤形成并且抑制已形成肿瘤的生长。