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背景恶性黑色素瘤是由源于神经嵴的色素细胞恶变而产生的一种皮肤癌,通常见于皮肤,但也可能在鼻腔、眼睛中出现。早期局部的黑色素瘤可通过外科手术切除从而痊愈;一旦黑色素瘤细胞发生转移,其致死率将大大增加,且现有的治疗手段很难取得有效的治疗效果。神经细胞粘附分子(NCAM)首先发现于中枢神经系统,是一类属于免疫球蛋白超家族的细胞粘附分子。有研究显示,NCAM在多种肿瘤进程中均发挥关键作用。但在黑色素瘤细胞中,NCAM是如何调控黑色素瘤细胞转移;以及黑色素瘤细胞中高表达的NCAM140、NCAM180对其转移产生了怎样的影响,目前却并不清楚。目的1.探究NCAM140/180对黑色素瘤B16F0细胞增殖、迁移以及侵袭的影响;2.阐明NCAM140/180促进黑色素瘤B16F0细胞转移的分子机制。方法1.NCAM140/180对小鼠黑色素瘤B16F0细胞增殖能力的影响将NCAM140/180腺病毒侵染黑色素瘤B16F0细胞,48 h后将细胞接种到96孔板,通过MTT法测定过表达NCAM140/180对黑色素瘤B16F0细胞增殖的影响。将NCAM140/180过表达的黑色素瘤B16F0细胞接种到6孔板中,通过平板克隆形成实验测定NCAM140/180对黑色素瘤B16F0细胞克隆形成能力的影响。2.NCAM140/180对小鼠黑色素瘤B16F0细胞迁移和侵袭能力的影响将NCAM140/180腺病毒侵染黑色素瘤B16F0细胞,48 h后更换为无血清培养液饥饿处理12 h,在培养板底部划出痕迹,不同时间点照相记录直至某一组划痕愈合,通过计算划痕面积的变化,得出黑色素瘤B16F0细胞的迁移能力的的变化。将NCAM140/180腺病毒侵染黑色素瘤B16F0细胞,48 h后更换为无血清培养液饥饿处理12 h,使用康宁公司的Transwell小室检测黑色素瘤B16F0细胞的迁移以及侵袭能力的变化,制备的NIH-3T3条件培养基为下室趋化因子培养液。接种24 h后,擦除上室未迁移的细胞,通过结晶紫染色后计算发生迁移的细胞个数,并分析其迁移能力的变化。侵袭小室预先包被基质胶,实验方法与Transwell迁移实验相同。3.NCAM140/180促进小鼠黑色素瘤B16F0细胞增殖、迁移和侵袭的分子机制将NCAM140/180腺病毒侵染黑色素瘤B16F0细胞,48 h后提蛋白,通过蛋白质免疫印迹检测相关信号分子FGFR、AKT以及转录因子CREB、c-Jun活化水平的变化,通过PKA酶活检测试剂盒测定PKA活化水平的变化;并通过引入相关信号通路的特异性抑制剂,进一步确认该信号通路在黑色素瘤B16F0细胞增殖、转移过程中的作用。结果1.NCAM140/180促进小鼠黑色素瘤B16F0细胞增殖通过MTT实验测得的吸光度值,间接反映了活细胞的数目,结果显示,过表达NCAM140/180组的吸光度值均显著高于对照组,过表达NCAM140/180组活细胞数目显著多于对照病毒组,说明NCAM140/180对于小鼠黑色素瘤B16F0细胞的增殖有促进作用;平板克隆实验也显示,NCAM140/180显著促进小鼠黑色素瘤B16F0细胞的克隆形成。2.NCAM140/180促进小鼠黑色素瘤B16F0细胞迁移和侵袭划痕实验结果显示,过表达NCAM140/180组划痕愈合均早于对照组;Transwell迁移实验和侵袭实验结果显示,过表达NCAM140/180显著促进了小鼠黑色素瘤B16F0细胞的迁移和侵袭。这显示了NCAM140/180对于小鼠黑色素瘤B16F0细胞的迁移和侵袭均有促进作用。3.NCAM140/180通过FGFR/AKT/PKA信号通路促进小鼠黑色素瘤B16F0细胞增殖、迁移和侵袭蛋白质免疫印迹结果及抑制剂实验显示,过表达NCAM140/180细胞中FGFR、AKT、PKA蛋白的磷酸化水平均呈现上升趋势,在加入抑制剂后,信号的活化程度则显著降低,并且显著抑制了小鼠黑色素瘤B16F0细胞的增殖以及迁移能力。以上结果显示,NCAM140/180通过激活FGFR/AKT/PKA信号通路促进小鼠黑色素瘤B16F0细胞增殖、迁移以及侵袭。结论本研究发现,NCAM140/180均能够显著促进小鼠黑色素瘤B16F0细胞的增殖、迁移以及侵袭,且主要是通过活化FGFR/AKT/PKA信号发挥其生物学功能,这将为黑色素瘤的治疗提供新的靶标。相关分子机制的研究也为抑制黑色素瘤转移药物的开发提供了理论基础。