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肉鸡腿病是家禽生产中存在的一个重要的经济和福利问题,给肉鸡生产造成了极大困扰。导致腿病发生的原因十分复杂,生产中难以控制,但通过遗传选择可有效降低腿病的发生率。肢体内外翻畸形(Valgus-varus deformity,VVD)是一种肉鸡常见的长骨畸形病,临床上以胫跗骨和跗跖骨之间内翻或外翻为主要特征,即表现为跗关节内弧或者外撇。本研究以哈伯德肉鸡为研究对象,首先采取对照-病例设计,比较两组肉鸡生长性能、骨骼形态计量学指标、骨骼质量、骨骼中钙、磷、灰分含量、血液生化指标含量的异同,并进行病理组织学检查。其次以健康组鸡和VVD腿病组鸡为材料,GWAS和转录组测序技术,筛选了肉鸡VVD腿病易感基因。最后对易感基因FGF10、FGF12的CDS区序列进行了克隆及生物信息学分析,并探究其在不同组织中的表达规律,初步分析了FGF10、FGF12蛋白结构。并在软骨细胞中过表达了鸡FGF10、FGF12基因,初步探究其功能作用。以上研究为探究肉鸡VVD腿病发病机制,保障肉鸡腿部健康提供一定的参考价值和依据。主要结果如下:研究一:VVD腿病肉鸡与健康肉鸡生长性能、骨骼形状及血脂指标差异分析1、通过临床检查、病理剖检确定了肉鸡腿病类型是VVD。2、对唐山某养殖场肉鸡腿病发病情况进行了调查,肉鸡VVD腿病的发生率是1.75%(n=52,000),患VVD腿病的肉鸡公母比例基本为1:1,左腿的发病率与右腿的发病率基本相同,外翻畸形的发病率为97.9%,内翻畸形的发病率仅为2.1%,单侧肢体发病率为17.6%,双侧肢体发病率为82.4%。3、与健康组肉鸡相比,腿病组肉鸡的体重、胫长、胫围显著降低(P<0.05);腿病组肉鸡胫骨骨指数,跖骨骨指数显著增加(P<0.05),骨密度显著下降(P<0.05);腿病组肉鸡血钙含量,胆固醇含量,低密度脂蛋白含量显著上升(P<0.05),血磷含量,碱性磷酸酶含量,高密度脂蛋白含量显著下降(P<0.05)。4、病理组织学检查结果显示,与健康组肉鸡相比,腿病组肉鸡骨小梁纤细,排列紊乱,骨小梁面积下降,软骨细胞数显著增多,且存在软骨细胞钙化障碍或者钙化延迟的现象。研究二:肉鸡VVD腿病转录组测序及易感基因筛选1、以3个健康组肉鸡和3个VVD腿病组肉鸡的腿部软骨为材料,构建了 6个cDNA文库,进行了转录组测序,共获得78.39 GB的数据。2、对转录组数据进行分析,根据|log2FC|≥1和P<0.05的标准,共筛选差异表达mRNA 231个,其中134个mRNA显著上调,97个mRNA显著下调;同时筛选得到了 23个差异的lncRNA,其中9个lncRNA显著上调,14个lncRNA显著下调。3、通过预测差异lncRNA的靶基因,并对差异表达的mRNA和差异表达的lncRNA的靶基因进行功能注释,发现其主要被富集在P53,MAPK,Toll-like receptor,Jak-STAT,Hedgehog和PPAR等与骨骼和血管发育相关的信号通路上。4、通过构建了 lncRNA-mRNA互作网络分析和功能查询,进一步筛选到FGF10、FGF12、BMP3和DENND4A四个可能与VVD腿病发生有关的基因。通过差异表达分析显示,与健康组肉鸡相比,BMP3基因在腿病组肉鸡软骨组织中的相对表达量下降,DENND4A基因的相对表达量上升。5、随机挑选的8个mRNAs或lncRNAs进行荧光定量验证,表达结果与转录组测序结果趋势一致,表明转录组数据真实可信。研究三:GWAS分析及其与转录组整合分析筛选肉鸡VVD腿病易感基因1、以126个健康组肉鸡和122个VVD腿病组肉鸡为材料,对腿病组肉鸡的行走能力进行步态评分,结果显示,VVD腿病肉鸡的步态评分基本都在3-5分之间。2、构建了 248个GBS测序文库,测序质控后,剔除15个质检不合格的个体数据,剩余233个个体测序数据整体变异系数为24.6%,均一性良好。PCA分析结果显示试验鸡群群体结构无明显群体分层现象,即有相似的遗传背景。3、通过对测序数据处理,最终共获得272,814个SNPs,使用混合线性模型与VVD腿病、步态评分结果、体重等12个指标进行关联分析,结果显示,均未发现显著关联的SNP位点。研究四:鸡FGF10和FGF12基因功能研究1、克隆获得了鸡FGF10和FGF12基因的CDS序列的全长。其中,FGF10基因mRNA全长为950bp,CDS区全长为639 bp,可编码212个氨基酸残基;鸡FGF12基因mRNA序列全长825bp,CDS区全长732 bp,编码243个氨基酸残基。2、鸡FGF10和FGF12基因在各组织中表达分布检测结果显示,FGF10和FGF12基因在法氏囊组织中高丰度表达,在腿肌中低丰度表达。与健康肉鸡相比,FGF10基因在腿病肉鸡软骨组织的表达量显著高于健康肉鸡(P<0.01),FGF12基因在腿病肉鸡软骨组织的表达量高于健康肉鸡,但未达到显著水平。3、对鸡FGF10、FGF12氨基酸序列生物信息学分析表明,鸡的FGF10和FGF12有典型的功能结构域,FGF10有一个跨膜螺旋区,但FGF12无跨膜结构域。鸡的FGF10和FGF12蛋白的二级结构,都具有α-螺旋(Alpha helix,Hh)、延伸链(Extended strand,Ee)和无规则卷曲(Random coil,Cc)三种二级结构,蛋白三级结构预测结果与二级结构预测结果一致。4、系统进化分析表明,FGF10基因与FGF12基因有较近的进化关系。5、过表达鸡FGF10基因,软骨细胞中胶原Ⅱ的含量显著下降(P<0.05)。