悬浮培养银杏细胞产生黄酮类物质的技术研究

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银杏叶中的黄酮类物质具有广泛的药理作用,具有广阔的市场前景。因此实现银杏细胞大规模培养生产黄酮是保证今后市场需求的非常有希望的手段之一。本实验以银杏未伸展的幼叶为外植体,建立起愈伤组织培养体系和细胞悬浮培养体系,并进行了10L发酵罐培养,取得了较满意的结果。 研究表明,银杏叶片和叶柄在很多培养基上都能诱导出愈伤组织,叶片和叶柄在MS附加激素NAA1.0mg·L-1,6-BA1.0mg·L-1培养基上诱导率分别达到100﹪和80﹪,可以作为最佳诱导培养基。同时还得出结论,叶片的诱导效果要比叶柄的好。银杏愈伤组织培养过程中很容易褐变,致使继代培养无法进行,加入3.0mg·L-1Vc可以很好的控制褐变。不同激素组合对细胞生长和黄酮类物质合成有较大影响,3.00mg·L-1NAA+1.00mg·L-16-BA最有利于细胞生长和黄酮类物质的合成,30天细胞增长量达4.88g·瓶-1,黄酮合成量达11.20mg·g-1。实验得知,银杏愈伤组织在固体培养基中细胞生长和黄酮累积均呈S型曲线,20天细胞鲜重达最大值,25天黄酮含量达最高。 在此基础上,建立了叶来源的悬浮细胞体系。结果表明,1.0mg·L-1NAA+0.5mg·L-16-BA的激素组合下,细胞鲜质量增加最多,达3.64g·瓶-1,1.5mg·L-1NAA+1.0mg·L-16-BA处理下总黄酮含量最高,达11.01mg·g-1。培养基pH为6.0时,细胞增长量和总黄酮含量都达到最大值,细胞生长量3.96g·瓶-1,总黄酮含量10.08mg·g-1。对于银杏细胞来说,细胞生长和黄酮类物质累积的最适蔗糖浓度均为35g·L-1。添加微量乙烯利(≤60mg·L-1)使细胞干重和黄酮类物质积累都有提高,但提高乙烯利浓度,则无论细胞干重和总黄酮含量都迅速下降。茉莉酸甲酯抑制细胞生长,且浓度越高,抑制作用越强,添加一定浓度的茉莉酸甲酯可以使银杏黄酮产量提高,实验结果表明,培养第9天添加20μmol·L-1浓度的茉莉酸甲酯可以有效提高总黄酮产量而不影响细胞生长,其中总黄酮含量可达到10.93mg·L-1。 本文还探讨了两相培养对银杏细胞产生黄酮类物质的影响,以正十六烷为第二相,以二甲基亚砜作为产物释放剂,正十六烷的加入对细胞生长有抑制作用,对黄酮类物质的合成有促进作用,细胞干重随着正十六烷含量的增加而减少,总黄酮产量随着正十六烷含量的增加而增加,最高可达125.36mg·L-1。 利用10L气升式生物反应器培养培养银杏细胞,装液量为5L,pH为5.8时较有利于细胞的生长和黄酮的积累,其细胞干重可达10.03g·L-1,总黄酮含量可达9.2mg·L-1。
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