胶质母细胞瘤是颅内肿瘤中最常见且恶性程度最高的恶性肿瘤,由于肿瘤高度增殖、侵袭以及对放化疗的耐受性,患者即使接受最积极的治疗手段,患者依然要面临手术疗效差、术后极易复发、生存期短的境地。因此,亟需我们开发新的治疗药物,寻找有效的治疗方法。木犀草素是一种天然黄酮类化合物,有文献报道其在体外、体内都有明确的抗肿瘤作用。研究表明,肺癌中木犀草素是Nrf2的有效的和选择性抑制剂,能有效抑制肺癌裸鼠种植瘤的生长并提高化疗药物的敏感性。胰岛素样生长因子(IGF-1)在多种恶性肿瘤组织中高表达,其介导的信号通路参与了肿瘤细胞凋亡调控。PI3K/AKT/mTOR信号通路的过度活化在肿瘤的发生发展过程中具有十分重要的作用,与肿瘤细胞的恶性生物学行为侵袭/迁移、凋亡和耐药等有着密不可分的关系。内质网应激反应是细胞应对外界刺激的一种保护性反应,但是研究表明长时间持续的内质网应激反应会诱导细胞发生凋亡。因此,本研究以胶质母细胞瘤细胞系U251MG和U87MG为体外模型,裸鼠皮下种植瘤为体内模型,详细研究木犀草素的抗胶质母细胞瘤作用,其对胶质母细胞瘤侵袭/迁移、凋亡的影响,以及对胶质母细胞瘤替莫唑胺耐药细胞的作用,并研究IGF-1R/PI3K/AKT/mTOR通路以及药物所引发的肿瘤细胞的内质网应激反应在这些过程中的作用。本课题共分为以下五个研究部分:第一部分木犀草素对胶质母细胞瘤细胞迁移的作用目的:研究木犀草素能否抑制胶质母细胞瘤细胞的迁移。方法:体外培养胶质母细胞瘤细胞系U251MG和U87MG,接种于96孔,利用CCK-8进行细胞增殖实验,将不同浓度梯度0,5,10,20,40,80μmol/L的木犀草素处理细胞24h后用CCK-8检测增殖,确定药物的给药浓度和时间(0,5,10,20μmol/L,24h)。之后再检测对U251MG和U87MG迁移的影响;利用western blot检测侵袭和迁移相关蛋白MMP-9,MMP-2,TIMP-1,TIMP-2的变化;利用 westernblot 检测 EMT 相关蛋白 Vimentin,β-catenin,N-cadherin 和 E-cadherin水平变化;利用罗丹明标记的鬼笔环肽染色细胞骨架蛋白,检测木犀草素对细胞形态和迁移表型的影响。结果:细胞增殖实验结果显示木犀草素浓度小于40μmol/L时对肿瘤细胞增殖没有明显影响;细胞划痕迁移实验表明木犀草素能显著抑制胶质母细胞瘤细胞的迁移;木犀草素能够明显下调侵袭和迁移相关蛋白MMP-2,MMP-9的表达而上调抑制蛋白TIMP-1,TIMP-2的表达;此外木犀草素能够阻止胶质母细胞瘤细胞的EMT过程。结论:木犀草素可以抑制胶质母细胞瘤细胞的迁移。第二部分木犀草素对胶质母细胞瘤细胞凋亡的影响目的:确定木犀草素对胶质母细胞瘤细胞的凋亡的作用。方法:利用胶质母细胞瘤细胞系U251MG和U87MG以及小鼠原代血管内皮细胞模型,用不同浓度的木犀草素处理细胞,用CCK-8检测细胞活力确定其对肿瘤细胞的杀伤作用;通过Annexin V和Propidium iodode(PI)染色利用流式细胞仪检测对胶质母细胞瘤细胞凋亡的影响。同时用TUNEL染色、免疫荧光和western blot检测cleaved-caspase-3的表达进一步确定其对肿瘤细胞凋亡的作用。利用裸鼠皮下种植模型,检测木犀草素在体内的抗肿瘤作用,并用western blot检测凋亡相关蛋白的表达,利用TUNEL检测肿瘤组织中的凋亡情况。结果:我们发现木犀草素在40,80μmol/L时在体外具有明显促进肿瘤细胞凋亡的作用;木犀草素能明显提高肿瘤细胞的TUNEL水平,cleaved-caspase3的蛋白水平明显升高;木犀草素能通过促进凋亡抑制胶质母细胞瘤裸鼠皮下种植瘤的生长。结论:木犀草素能促进胶质母细胞瘤细胞的凋亡并抑制体内肿瘤生长。第三部分内质网应激反应在木犀草素引发的胶质母细胞瘤细胞凋亡中的作用目的:明确内质网应激反应是否参与了木犀草素引起的肿瘤的凋亡。方法:利用荧光检测肿瘤细胞在药物刺激后ROS的水平情况,并利用western blot检测木犀草素(0,40,80μM)作用24h后氧化应激相关蛋白Nrf2、NQO-1、HO-1的水平变化:利用western blot检测40 μM木犀草素刺激不同时间(0,1,3,6,12,24h)及不同浓度(0,5,10,20，40,80μM)作用24h后内质网应激反应相关蛋白 p-PERK,p-eIF2α,ATF4,CHOP,Cleaved-caspase-12 的蛋白水平变化情况;利用JC-1染料检测40μM木犀草素处理24h后肿瘤细胞线粒体的膜电位变化情况,及免疫荧光检测处理后细胞色素c的表达情况,利用western blot检测线粒体凋亡相关蛋白Bcl-2,Bax的表达情况;利用western blot检测裸鼠皮下种植瘤中内质网应激相关蛋白ATF4,CHOP,Cleaved-caspase-12的表达情况。结果:用药物木犀草素刺激胶质母细胞瘤细胞后能够诱导其ROS水平的升高,降低氧化应激相关蛋白Nrf2、NQO-1和HO-1的水平。进而激活内质网应激反应,p-PERK、p-eIF2α蛋白在40μM木犀草素处理6h时最高,而CHOP,Cleaved-caspase-12和Cleaved-capase-3的水平在24h最高,而且在体外以剂量依赖形式促进促进内质网应激反应相关蛋白p-PERK、p-eIF2α、CHOP的表,在裸鼠体内同样具有促进ATF4、CHOP、Cleaved-caspase-12的水平。木犀草素的处理能导致肿瘤细胞内线粒体膜电位的下降,并抑制Bcl-2的表达而促进促凋亡蛋白Bax的表达。结论:木犀草素通过内质网应激反应诱导肿瘤细胞发生凋亡。第四部分p-IGF-1Rβ/PI3K/AKT/mTOR信号通路在木犀草素引起的胶质母细胞瘤细胞生物行为变化中的作用目的:研究木犀草素是否通过调控p-IGF-1Rβ/PI3K/AKT/mTOR信号通路来发挥抗胶质母细胞瘤作用。方法:用不同浓度(0,5,10,20,40,80μM)的木犀草素处理胶质母细胞瘤细胞U251MG 和 U87MG 24h 后,通过 western blot 检测细胞 p-IGF-1Rβ/PI3K/AKT/mTOR通路上各信号分子蛋白水平的变化;用p-IGF1R特异性激动剂IGF-1(100ng/ml)处理后,再次检测这些蛋白的变化,并利用western blot检测侵袭/迁移相关蛋白 MMP-2,MMP-9,TIMP-1,TIMP-2,Cleaved-caspase-3 的水平。结果:在木犀草素起到抑制胶质母细胞瘤细胞迁移的条件下,其能显著抑制细胞内IGF-1Rβ,AKT,mTOR的磷酸化水平,而对其总蛋白水平没有明显影响,说明木犀草素能抑制p-IGF-1Rβ/PI3K/AKT/mTOR信号通路;此外加入IGF-1后,升高的TIMP-1,TIMP-2，E-cadherin的水平出现下降,而被抑制的MMP-2,MMP-9,Vimentin的蛋白水平重新恢复。结论:木犀草素通过抑制p-IGF-1Rβ/PI3K/AKT/mTOR信号通路达到抑制胶质母细胞瘤细胞迁移和EMT过程的作用。第五部分木犀草素对胶质母细胞瘤替莫唑胺耐药细胞系的作用目的:通过建立的胶质母细胞瘤U251MG替莫唑胺耐药细胞系,验证其耐药表型,研究木犀草素对该耐药细胞系的促凋亡作用,及是否能逆转其对替莫唑胺的敏感性。方法:体外培养U251MG和U251MG-TR细胞,利用倒置显微镜观察期形态的变化,利用CCK-8检测其对替莫唑胺IC-50的变化,利用western blot和QRT-PCR检测多药耐药相关基因MRP-3的蛋白和mRNA表达;利用CCK-8检测不同浓度木犀草素(0,5,10,20,40,80μM)对耐药细胞系的杀伤作用,并与U251MG非耐药细胞比较,利用AV/PI染色在流式细胞仪上检测其对耐药细胞凋亡的作用,利用western blot检测凋亡相关蛋白Cleaved-caspase-3,Bcl-2,Bax的蛋白水平变化;利用western blot,QRT-PCR和免疫荧光检测耐药细胞系中Nrf2的水平,利用western blot,QRT-PCR检测耐药细胞系中NQO-1,HO-1的蛋白和mRNA水平;利用Nrf2慢病毒转染U251MG耐药细胞下调其Nrf2的表达,再利用CCK-8检测木犀草素对其的杀伤作用。将不同浓度的木犀草素和替莫唑胺联用,利用CCK-8检测其存活率,用AV/PI标记用流式细胞仪检测细胞凋亡,利用western blot检测相应Cleaved-caspase-3,Bax的蛋白水平。结果:我们实验室构建的U251MG替莫唑胺耐药细胞系(U251MG-TR)具有明显的耐药细胞特征,细胞变大而且成团块生长;其对替莫唑胺具有明显的耐药性,IC-50值上升9倍左右,多药耐药相关基因MRP-3的mRNA和蛋白水平明显升高;木犀草素能显著降低U251MG-TR的存活率,并且耐药细胞比非耐药细胞对木犀草素更加敏感,药物刺激后U251MG-TR细胞凋亡明显升高,凋亡相关蛋白Cleaved-caspase-3,Bax的水平明显升高,而抑制凋亡蛋白Bcl-2水平明显下降。U251MG-TR细胞中氧化应激相关蛋白Nrf2,NQO-1,HO-1的mRNA和蛋白水平都明显升高,用慢病毒将U251MG-TR细胞中Nrf2干扰后能降低耐药细胞对木犀草素的敏感性;木犀草素能够部分逆转U251MG-TR对替莫唑胺的耐药性。结论:木犀草素能诱导胶质母细胞瘤替莫唑胺耐药细胞的凋亡。总结本课题的研究结果从体外和体内两个方面均证实木犀草素可以通过p-IGF1R-β/PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制胶质母细胞瘤细胞的迁移;并能通过激活持续的内质网应激反应而促进胶质母细胞瘤细胞发生凋亡:此外U251MG替莫唑胺耐药细胞对木犀草素十分敏感,这可能和耐药细胞高表达的Nrf2有关;而且,低剂量木犀草素就能提高耐药细胞对替莫唑胺的敏感性。因而,我们认为木犀草素具有多重抗胶质母细胞瘤作用,内质网应激反应诱导的凋亡在抗肿瘤过程中具有重要作用,可以为胶质母细胞瘤的治疗提供新的思路。