本论文涉及两个部分,即《鼠疫耶尔森氏菌III型分泌系统蛋白YscI-YscF相互作用的研究》和《鼠疫耶尔森氏菌蛋白质组学分析及新毒力因子的鉴定。摘要及正文将分为两个部分撰写。摘要一 鼠疫耶尔森氏菌III型分泌系统蛋白YscI-YscF相互作用的研究III型分泌系统（Type III Secretion System,T3SS）是一种高度保守的毒力机制,广泛分布于革兰氏阴性菌中,能够将效应蛋白直接分泌到宿主细胞的细胞质中。该系统的结构类似于一支注射器,由两部分组成,分别是横跨于细菌内膜、周质及外膜的多环基座以及将毒力蛋白输送到宿主细胞内的中空针头。鼠疫菌的T3SS由pCD1质粒编码而成,是由20余种蛋白质构成的一种超分子复合物,含有许多高度保守结构,通过耗能将分泌性V抗原（LcrV）和耶尔森氏菌外膜蛋白（Yersinia outer proteins,Yops）由宿主细胞表面形成的小孔结构注入到宿主细胞内,从而达到干扰细胞发挥其正常生理功能的目的。鼠疫菌的pCD1质粒共编码90多个基因,除去部分假基因和转座酶相关基因后,共57个基因编码T3SS相关蛋白。在本实验室的前期工作中,已通过酵母双杂交阵列筛选技术筛选到57个蛋白之间的21个相互作用对,其中新发现12对,包括YscF-YscI。YscF的多聚体在细菌表面形成注射小体的针状结构,YscI是连接T3SS装置分泌通道内外环的蛋白。前期实验中已采用GST-pull down验证了YscI-YscF体外存在相互作用,并通过构建Ysc I截短突变体的方法确定介导二者体外相互作用的结构域位于YscI的第83-92位氨基酸。本研究中,将通过免疫共沉淀等方法继续验证YscF-YscI的体内相互作用关系,并探讨其相互作用的生理功能。首先,本研究利用λ-Red重组系统构建鼠疫菌yscI基因突变株。再以阿拉伯糖诱导的pBAD24质粒为载体构建带FLAG标签的yscI互补株及yscI截短突变体,并将成功构建的新载体导入yscI突变株,分别为△yscI-FLAG-YscI、△yscI-C△73-85、△yscI-C△83-92、△yscI-C△93-102和△yscI-C△93-102。接下来,运用免疫共沉淀（Co-IP）的方法在FLAG树脂结合下来的样品中检测到了YscF蛋白,验证了YscI-YscF在体内存在相互作用;并使用同样的实验方法对不同突变菌株进行检测,结果,对△yscI-C△83-92、△yscI-C△93-102菌株的Co-IP实验中,FLAG树脂结合下来的样品中未检测到YscF蛋白。以上结果说明,影响YscI-Ysc F体内相互作用的关键结构域位于YscI蛋白C末端的第83-102位氨基酸。本研究分别运用YscF聚合体交联的方法检测上述构建的yscI互补株以及yscI截短突变株在细菌表面组装YscF针状结构的能力;运用WB免疫印迹的方法检测其表达及分泌YscI、YscF以及效应蛋白YopN、YopM、Yop E、YopK和LcrV的能力。结果表明:鼠疫菌yscI互补株和yscI截短突变株均可以在菌体内表达Ysc I和YscF,但不能分泌到上清中;在△yscI、△yscF和△yscI-C△83-92的菌体表面未检测到YscF多聚体,在其分泌上清中也未检测到效应蛋白;在△yscI-C△93-102细菌表面能检测到YscF多聚体,但该菌株不能够正常分泌效应蛋白。以上结果阐明,当YscI的第83-92位氨基酸缺失时,该突变株不能形成针状结构且无法分泌效应蛋白;当第93-102位氨基酸缺失时,该菌株组装YscF针状结构的能力受到一定影响,但其分泌效应蛋白的功能并未完全丧失。针对YscI的83-92位氨基酸区域进行序列比对结果发现Ysc I的第85、86、88和92位氨基酸与YscF同源性高。因此,本研究构建了C末端带有FLAG标签的yscI点突变体,并导入yscI突变株,分别为△yscI-CW85A、△yscI-CS86A、△yscI-CI88A以及△ysc I-CI92A。利用免疫共沉淀方法检测与YscF体内相互作用,结果在对△yscI-CW85A、△yscI-CS86A菌株的Co-IP实验中,FLAG树脂结合下来的样品中未检测到YscF蛋白。利用GST-pull down方法检测与YscF体外相互作用,结果发现YscI-W85A或YscI-S86A与YscF未发生结合。以上结果表明,YscI第85或86位氨基酸的缺失,同时影响了YscI与YscF之间体内外的相互作用。本研究进一步发现无法在△yscI-CW85A和△yscI-CS86A的细菌表面检测到YscF多聚体,也无法在其上清中检测到效应蛋白。这一结果阐明,YscI的第85或86位氨基酸缺失导致YscI-YscF失去相互作用,并且该突变株也不能形成针状结构和分泌效应蛋白。本研究还通过观察细菌感染Hela细胞后形态的变化,以及用无标记细胞实时定量分析法研究鼠疫菌yscI截短及点突变株的细胞毒性。在显微镜下,我们看到野生株鼠疫菌感染3h后的Hela细胞明显变圆,表明效应蛋白破坏细胞骨架;而△yscI、△yscF、△yscI-C△83-92、△yscI-C△93-102、△yscI-CW85A以及△yscI-CS86A感染的Hela细胞形态更接近于正常细胞,这说明以上菌株对Hela细胞的毒力作用已大幅度减弱。本研究还利用免疫印迹的方法检测了yscI截短及点突变株感染Hela细胞后向胞内转运效应蛋白的能力,结果表明对HeLa细胞毒力明显减弱的几株突变株同样不能将效应蛋白Lcr V、Yop M和Yop E转运到细胞胞浆中。摘要二 鼠疫耶尔森氏菌蛋白质组学分析及新毒力因子的鉴定鼠疫（plague）是由鼠疫耶尔森氏菌引起的烈性传染病,主要由节肢动物跳蚤通过叮咬传染给宿主啮齿类动物,并有可能传播给人导致腺鼠疫、肺炎鼠疫和败血症等的发生,给人们造成了巨大的生命和财产损失。本研究利用蛋白质组技术,在鼠疫菌全基因组测序已完成的基础上,对鼠疫菌201株在两种不同的生理条件下,即26°C含钙（模拟跳蚤体内环境）和37°C低钙（模拟哺乳动物体内环境）的蛋白质组展开研究,并进一步发现鼠疫菌致病的新的关键毒力因子,为防治鼠疫菌和新疫苗研究提供更多方法和靶标。首先,本研究制备出鼠疫菌在26°C含钙和37°C低钙培养条件下的分泌蛋白质组和菌体蛋白质组。该过程主要使用TMH人工合成培养基培养鼠疫菌,在两种条件下培养8h,然后使用超滤法进行上清蛋白的浓缩,菌体用含尿素裂解液裂解,并用BCA试剂盒测量菌体蛋白和上清蛋白的浓度。此外,为了实现对鼠疫菌T3SS不同蛋白质组分的动态监控,在8h分泌时间内选择了一系列时间点作为分泌时间,分别为,80min、160min、240min、320min、400min和480min,制备出不同时间序列的分泌蛋白质组及菌体蛋白质组样品。在本研究中,我们通过同量异序化学标签（Tandem Mass Tags,TMT）法对样品进行定量分析。TMT是通过串联质谱同时定量鉴定不同样品中蛋白质的有效工具。这些小化学分子标签的结构类似,以共价结合赖氨酸的氨基末端的方式标记蛋白样品中的多肽。在质谱分析中,每种分子量的TMT标签都能生成一个特殊的离子图谱,通过比较不同标签标记的离子的相对丰度实现了对蛋白的相对定量。我们共检测到2141个鼠疫菌蛋白质,占基因组预测CDS的52.2%。其中1081个蛋白质同时出现在分泌和菌体蛋白质组中。将Score≥5和Unique Peptide≥2作为定义潜在分泌蛋白的标准,共在培养上清中检测到767个分泌蛋白,其中Yp-2058、Yp-3657和Yp₃415-Yp₃418几种未知功能的蛋白在37°C表达上调,可能与鼠疫菌在宿主动物中的毒力密切相关。在研究T3SS的分泌蛋白动态变化实验中,根据不同时间序列的蛋白质组样品的质谱结果分析,未观察到鼠疫菌T3SS蛋白组分随时间的蛋白特异性变化规律,推测可能是由于最短分泌时间80min时,分泌蛋白质种类已基本趋于稳定。本研究建立了一种新方法分辨哪些蛋白是T3SS的分泌蛋白,即将上清/菌体的PSM值大于1作为分泌蛋白的评判标准。发现根据上清/菌体的PSM值大于1为标准判断鉴定出的T3SS分泌底物的蛋白,均是文献中已经报道的分泌蛋白;而那些比值小于1的蛋白为T3SS结构蛋白、ATP酶以及转运蛋白等。在分子实验部分中,针对筛选出的高表达分泌蛋白质Yp₃416、Yp₃417、Yp₃418、Yp₂058和Yp₃657进行毒力及功能的验证。本研究采用基于p DS132自杀载体的方法构建yp₃416、yp₃418和yp₃416-3418的无痕突变株。分别以尾静脉感染途径和滴鼻感染途径对小鼠进行攻毒实验,绘制出生存曲线。结果表明,经尾静脉感染后,鼠疫菌野生株与yp₃416突变株,yp₃416-3418突变株的生存曲线差异有统计学意义,与yp₃418突变株无差异;滴鼻感染结果中,野生株与以上3株突变株的差异均有统计学意义。本研究还构建出yp₃416、yp₃417、yp₃418、yp₂058和yp₃657的β-内酰胺酶（TEM）报告质粒,导入鼠疫菌野生株后,分别感染Hela细胞。当靶蛋白进入宿主细胞时,与靶蛋白融合表达的β-内酰胺酶可降解细胞内CCF2-AM染料分子,在409nm光的照射下发出447nm的蓝光;而靶蛋白未进入细胞时,完整的CCF2-AM具有荧光能量共振转移现象,在409nm光的照射下发出520nm的绿光。利用该原理,研究Yp₃416、Yp₃417、Yp₃418、Yp₂058和Yp₃657五种靶蛋白能否被转运到真核细胞内。结果表明,以上五种蛋白均能转运到真核细胞内,且转运效率较高。这一结果为新鉴定分泌蛋白质因子功能的后续研究奠定了基础。