目的肺孢子菌肺炎(Pneumosystis pneumonia PCP),是由肺孢子菌引起的一种机会感染性致命性肺炎。常见于AIDS、恶性肿瘤、器官移植及其他免疫功能不全的人群,随着艾滋病在世界各地的蔓延流行,器官移植的开展,免疫抑制剂的广泛应用,肺孢子菌的机会性感染将成为一个严重的公共卫生问题。因此,国内外有许多学者致力于PCP防治策略以及疫苗方面的研究,但是至今尚无理想的防治措施问世。肺孢子菌55 kDa蛋白(p55)是肺孢子菌的主要抗原成分之一,能刺激宿主产生抗肺孢子菌的保护性免疫反应。但是肺孢子菌体外培养困难而致p55抗原来源受限,多个p55蛋白变异体的出现又使免疫效果受到影响,这些都对利用p55抗原进行免疫防治研究十分不利。本实验是通过网络数据库结合生物软件分析的方法,分析p55蛋白可能在肺孢子菌肺炎中起重要作用并具有较好抗原性参数的区域作为候选抗原表位,从5个p55蛋白变异体中共选取了十二个B细胞表位,将各表位进行串联后形成嵌合体,人工合成串联基因后进行体外表达,为PCP疫苗的深入研究提供实验依据。方法一、抗原表位预测运用生物信息学方法对p55蛋白的二级结构,亲水性,穿膜螺旋,N-糖基化位点,氨基酸序列的亲疏水性,表面可及性,分子柔韧性及抗原性参数进行预测分析,设计抗原表位多肽。二、基因合成和测序鉴定设计多表位的串联基因,命名为TAG,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成及测序验证。三、TAG串联基因原核表达载体的构建及鉴定将该TAG基因克隆到GST融合蛋白表达载体pGEX-6p-1上,构建重组质粒pGEX-6p-1/TAG,受体菌为E.coli DH5α菌株。将该含有该重组质粒的菌株于37℃增菌,按照小量质粒提取试剂盒方法将过夜培养菌液提取质粒,应用限制性内切酶进行酶切,行琼脂糖凝胶电泳。四、TAG串联基因的扩增及表达将被证实的含有重组质粒pGEX-6p-1/TAG的E.coli DH5α,在LB液体培养基中37℃增菌,IPTG诱导其表达,将菌体变性后进行8%SDS-PAGE电泳。五、Western Blotting分析将表达目的蛋白和阳性对照GST蛋白的菌液离心后进行超声破菌,收集上清后100℃变性5min,8%SDS-PAGE电泳。45V,3h冰浴,转移到PVDF膜上,5%脱脂奶粉、0.1%BSA封闭2小时,以1∶500稀释浓度加入Anti-GST-Ab抗体,4℃过夜。PBST漂洗三次,加入HRP标记羊抗兔IgG,室温孵育2h,用DAB显色,30min内观察结果。六、TAG表达蛋白的初步纯化提取包涵体,1、2、4、6M尿素充分振荡、洗涤,将沉淀重悬含8M尿素的包涵体溶解缓冲液中于充分振荡溶解包涵体后,4℃离心,收取上清,将沉淀用PBS重悬。将上清、沉淀作Western Blotting分析后,确定最好的洗涤浓度进行大量纯化,以为下一步实验做好准备。结果一、抗原表位设计及基因合成选取目前报道的肺孢子菌p55蛋白的5个变异体当中有效抗原位点,共选取了十二个B细胞表位,将各表位进行串联,人工合成串联基因,全长1180bp,命名为TAG。二、重组质粒的构建及鉴定将串联基因连接在原核表达载体pGEX-6p-1上,命名为pGEX-6p-1/TAG,该重组质粒经测序证明碱基序列及读码框架完全正确。此外该重组质粒用限制性内切酶BamHI,NotI消化,经0.8%琼脂糖凝胶电泳证实片段大小与预期吻合,质粒构建成功。三、TAG在原核细胞中表达携带重组质粒pGEX-6p-1/TAG的E.coli DH5α经IPTG诱导表达后,8%SDS-PAGE电泳鉴定目的蛋白为分子量为69KD的GST融合蛋白,并出现于包涵体中。四、Western Blotting印迹分析分别携带质粒pGEX-6p-1/TAG和pGEX-6p-1的E.coli DH5α表达出分子量约69KD的GST-TAG融合蛋白和约26KD的GST蛋白。Western Blotting结果表明这两个蛋白能被Anti-GST-Ab识别,重组TAG蛋白被成功表达。五、重组TAG蛋白的初步纯化尿素法纯化重组TAG蛋白显示其最佳洗涤浓度为4M尿素,用8M尿素进行溶解可得较好效果。结论本研究以生物信息学为基础设计了肺孢子菌p55蛋白抗原表位的串联基因,成功地建立了表达多表位串联基因的原核表达系统。为进一步研制以该多表位串联基因为基础的疫苗研究奠定了良好的基础。