胃癌是常见的恶性肿瘤，其致死率居全球癌症死亡原因的第二位，而在我国胃癌居恶性肿瘤死亡原因的首位。即使患者接受了标准的根治性切除手术，术后进行规范化的治疗，进展期胃癌的5年生存率仍然徘徊在30%～40%左右。影响胃癌预后的因素很多，其中肿瘤细胞的分化程度起着十分重要的作用。不同分化程度的胃癌细胞，其增殖分化、侵袭转移的能力有所不同，肿瘤细胞的分化程度也可随肿瘤的进展而发生变化，如果这个过程可以通过干预某些基因或者信号通路达到抑制甚至逆转的目的，将会对患者的预后起到积极的作用，这是本实验设计的初衷。蛋白质组学（proteomics）及其相关技术是近年来新兴的分子生物学分支，是以基因编码的所有蛋白质组为研究对象，在整体水平上分析细胞内动态变化的蛋白质的组成成份、表达水平及修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，从而揭示蛋白质功能及其与细胞生命活动规律的关系以及基因表达调控机制的一个新的研究领域，其核心技术是以双相凝胶电泳（Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis，2-DE）为主的蛋白质分离技术和以质谱（mass spectrometry, MS）、生物信息学（Bioinformatics）为主的蛋白质鉴定技术。这些技术具备高通量、高灵敏度、高分辨率、可重复性强、高度自动化等优势，非常适合对蛋白质进行大规模的平行分离和分析，配合相应分析软件和数据库，可以在短时间内处理大量的数据。正因为如此，蛋白质组学技术在肿瘤研究中的应用成为热点，针对胃癌患者细胞、组织、血清、胃液的蛋白质组学研究屡见报道，内容也覆盖诊断、治疗、功能机制等多个方面。研究发现，胃癌的某些基因及其表达产物确会随疾病的发生发展而产生变化，并通过特定途径影响肿瘤的侵袭、转移等一系列过程。但在针对组织进行的研究中，大多是将胃癌组织和正常组织进行对比，如Jing等发现核基质蛋白hnRNP-A2/B1在胃癌组织中高表达，其可能通过影响某些促癌基因和抑癌基因的相互作用而影响胃癌的发展，是胃癌潜在的诊断标志物之一；Cai等发现胃贲门癌易出现转移，可能与糖代谢途径中某些酶类代谢异常有关，受此影响丙酮酸进入三羧酸循环的量明显增多，并促进肿瘤细胞的生长和转移，抑制该途径可为胃癌治疗提供潜在的靶点。除此之外，蛋白质组学技术应用于不同分化胃癌组织的对比研究却非常少见，因此本实验在前期工作的基础上进一步对不同分化程度胃癌组织中的差异蛋白进行分离鉴定，具有较强的先进性及临床实用价值。实验的第一部分到第二部分使用先进的双向荧光差异凝胶电泳技术（Two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis，2D-DIGE）结合LTQ离子阱型质谱仪对不同分化程度胃腺癌组织的差异表达蛋白质进行筛选鉴定，去除结构蛋白及功能非特异性蛋白后确定6种可能与胃癌分化有关的蛋白质，为丝氨酸蛋白酶抑制剂B1（serine protease inhibitor,clade B, member1，Serpin B1），钙磷脂结合蛋白Ⅲ（annexin A3），转录因子Nm23-H1，腺嘌呤磷酸核糖基转移酶APRT （AdeninePhosphoribosyltransferase In Apo And Amp），谷胱甘肽巯基转移酶Pi-1（GST-π-1），抗菌肽Dermcidin-lL，这为今后研究奠定了基础。第三部分对Serpin B1、annexinA3、Nm23-H1、APRT在不同分化胃癌组织中的表达进行了验证。考虑到丝氨酸蛋白酶抑制剂B1（Serpin B1）在肿瘤中的研究相对较少，并可能与一些肿瘤的侵袭和转移能力有关，因此第四至第五部分对Serpin B1进行了更深入的研究，进一步验证了Serpin B1在胃癌细胞及组织中的表达并探讨了Serpin B1与胃癌临床生物学行为的关系并就Serpin B1对人胃癌细胞侵袭能力影响的机制进行了初步研究。结果发现Serpin B1在胃腺癌组织中的阳性表达率明显高于正常胃组织并与某些临床生物学行为有关，提示Serpin B1可能通过某些通路参与了肿瘤的进展并与其恶性程度存在潜在联系，Serpin B1-siRNA转染胃癌细胞BGC823后对其中Serpin B1蛋白表达有明显抑制作用，并可有效降低胃癌细胞的侵袭及迁移能力，此过程可能是通过调节某些因子的表达实现的。虽然本实验证实Serpin B1的表达影响了胃癌细胞的侵袭转移能力，但是恶性肿瘤的发生和进展是多种基因和蛋白质相互作用的结果，任何单个基因均难以全面说明肿瘤复杂的生物学行为，且Serpin B1在胃癌中更深层次的机制仍需深入研究。今后的研究中，我们将继续利用蛋白质组学技术对不同样品的整体蛋白质表达情况进行检测，研究对象将不只限于组织和细胞，具有不同分化转移潜能的胃癌患者的血液、体液均可以作为研究对象，通过研究对比蛋白表达的差异及相互关系来阐明肿瘤可能的发生发展机制，并对其功能进行深入探讨，这种全面地、动态地、定量地分析，对阐明肿瘤发病机制、判断治疗效果、评估预后等方面都将具有潜在的重要价值。本课题五部分的具体内容如下：第一部分双向荧光差异凝胶电泳分离不同分化胃癌组织中的差异蛋白目的：将不同分化程度的胃癌组织中的蛋白质进行分离，找到其中的差异点，通过分析这些差异蛋白的功能与相互关系，可能达到的目的：①寻找潜在的诊断指标；②为肿瘤机制研究提供理论依据；③通过干预这些差异蛋白的表达，将有可能达到逆转肿瘤恶性行为的目的；④以此作为药物的分子靶标，有可能通过阻断相关信号通路、控制基因突变、阻止肿瘤血管生成、抑制肿瘤细胞的生长增殖而起到治疗肿瘤的作用。另外本实验还可验证双向荧光差异凝胶电泳技术在胃癌组织研究中的实用价值。方法：以不同分化程度的胃癌组织为研究对象，将纯化后的蛋白质应用双向荧光差异凝胶电泳（2D-DIGE）法进行蛋白质分离，电泳后进行荧光扫描并用Deep Purple进行后染色，采用Typhoon TRIO扫描，扫描得到的数字化图像用DeCyder Differential Analysis Software进行分析，找到差异明显的点，生成pick list导入Ettan spot picker进行挖点。结果：1.分化好、分化差两组胃癌组织标本分别用不同颜色的荧光染料标记，共胶分离后其各自的特异高表达蛋白将以各自所标记的荧光色彩呈现，结果显示不同分化程度胃癌组织中的确存在一些明显的差异蛋白质点，某些特异蛋白在分化差的腺癌中明显高表达，而另外一些则在分化好的腺癌中明显高表达。还有一些点表现为两种荧光染色的重合，可以认为是在不同分化类型胃癌中均有表达，这些蛋白质点虽不属于不同分化类型胃癌组织的差异蛋白，但有可能特异的存在于胃癌组织中，对今后的实验仍有潜在价值。2.选取背景清晰、分辨率高、重复性好的胶图，应用DeCyderDifferential Analysis Software选取39个差异明显的蛋白点，这些蛋白质点在分化好的样品中上调的有18个，下调的有21个（分化差的样品中则反之）。用Ettan spot picker进行挖点，以备第二部分实验使用。结论：1.以2D-DIGE作为分离技术对不同分化程度胃癌组织进行差异蛋白的分离，实验灵敏度高、结果准确、重复性好，但过程复杂，专业性强，实验成本高，说明2D-DIGE虽适用于临床组织学样本的研究，但广泛推广仍需过程。2.实验从不同分化的胃癌组织中分离出多个差异明显的点，说明不同分化程度的胃癌组织蛋白表达具有差异性，值得进一步研究。第二部分应用液相色谱-质谱联用技术鉴定双向荧光差异凝胶电泳分离出的差异蛋白质目的：应用通量高、速度快的LTQ离子阱型质谱仪配合相应分析软件和数据库对实验第一部分分离出的差异点进行鉴定，将鉴定出的差异蛋白质进行筛查，选取其中可能与分化密切相关的蛋白质作为进一步研究的对象并对其功能进行初步分析。方法：将第一部分实验中分离得到的差异蛋白点，通过胶内酶解制成待测样品，采用top-down技术，对差异表达的蛋白利用LTQ XL增强型离子阱型质谱仪，通过nanoESI-LC-MS/MS的分析方法进行蛋白质组学研究。LC-MS/MS数据使用Data dependent模式，操作软件为Xcalibur2.0Software。应用BioWorks3.3.1软件中的SEQUEST运算方法进行数据库检索。FASTA形式的蛋白数据库采用人类蛋白序列数据库，反库利用全部NCBI蛋白数据来生成，以确定其假阳性率。结果：1.双向荧光差异凝胶电泳中切取差异明显的蛋白质点39个，共鉴定出48种蛋白质，筛选后经功能分析确定6种可能与肿瘤分化有关的蛋白质，为丝氨酸蛋白酶抑制剂B1（serine protease inhibitor, clade B,member1，Serpin B1），钙磷脂结合蛋白Ⅲ（annexin A3），转录因子Nm23-H1，谷胱甘肽巯基转移酶Pi-1（GST-π-1），腺嘌呤磷酸核糖基转移酶APRT，抗菌肽Dermcidin-lL。2.对比胶图发现Serpin B1、annexinA3在分化差的胃腺癌组织中表达增强，而APRT、Nm23-H1、GST-π-1、Dermcidin-lL则在分化好的胃腺癌中表达增强。结论：1.双向荧光差异凝胶电泳（2D-DIGE）结合LTQ XL离子阱型质谱仪，通过nanoESI-LC-MS/MS的分析方法进行蛋白质组学研究，非常适合临床蛋白质标本的大规模的平行分离和分析，该质谱仪具有高度自动化、高通量、高速度扫描等优势，可以在短时间内进行大规模数据处理。2. Serpin B1、annexin A3在分化差的胃腺癌组织中表达增强，而APRT、Nm23-H1、GST-π-1、Dermcidin-lL则在分化好的胃腺癌中表达增强，提示这些蛋白的表达与分化程度密切相关，可能直接或间接影响着胃癌的侵袭转移等特质，值得深入研究。3.初步分析显示这些差异蛋白质在细胞信号传导、维持细胞形态及正常防御功能、促进细胞分裂增殖及细胞凋亡、侵袭转移等方面具有重要价值，但在胃癌中的作用尚待研究。4.经鉴定得出的48种蛋白质，并非均为分化相关蛋白质，有些是结构蛋白或功能非特异性蛋白，说明鉴定结果的特异性仍有待提高，这些蛋白在进一步实验前予以筛除。一些差异点未鉴定出对应的蛋白质，这可能与实验过程中蛋白磷酸化（中性丢失）、甲基化等修饰作用有关或是这些蛋白酶解后没有形成理想的适宜质谱鉴定的片断，另外也可能与SEQUEST算法的问题有关。第三部分应用Western blot及qRT-PCR技术验证不同分化胃癌组织中选定差异蛋白质的表达目的：对鉴定出的丝氨酸蛋白酶抑制剂B1（serine protease inhibitor,clade B, member1，Serpin B1），钙磷脂结合蛋白Ⅲ（annexin A3），转录因子Nm23-H1，腺嘌呤磷酸核糖基转移酶APRT（Adenine Phosphoribosyl-transferase In Apo And Amp）在胃癌中的表达进行验证，观察组织中这些因子的表达情况是否与蛋白质组学鉴定的结果相符。方法：1.应用qRT-PCR法对检出的因子在mRNA水平上进行验证，以GAPDH为内参照基因，计算得到目的基因表达的相对定量值，经对比P <0.01或0.05有统计学意义。2.提取总蛋白，应用Western blot法对检出的差异蛋白进行验证，以GAPDH为内参照。利用BioRad图像分析系统测定蛋白条带的积分光密度值，以目的蛋白与内参照蛋白的IOD值的比值表示目的蛋白的表达水平。结果：1.应用qRT-PCR技术对不同分化程度胃癌组织中四种差异蛋白的mRNA表达水平进行验证，结果显示：丝氨酸蛋白酶抑制剂B1（SerpinB1）、钙磷脂结合蛋白Ⅲ（annexin A3）在分化差的胃腺癌组织中表达增强，转录因子Nm23-H1、腺嘌呤磷酸核糖基转移酶（APRT）则在分化好的胃腺癌中表达增强（P均<0.01），与蛋白质组学所得结果符合。2.应用Western blot技术对不同分化程度胃癌组织中四种差异蛋白的表达水平进行验证，结果显示：丝氨酸蛋白酶抑制剂B1（Serpin B1）、钙磷脂结合蛋白Ⅲ（annexin A3）在分化差的胃腺癌组织中表达增强，而转录因子Nm23-H1、腺嘌呤磷酸核糖基转移酶（APRT）则在分化好的胃腺癌中表达增强，结果也与蛋白质组学所得结果吻合。结论：1.无论从mRNA或蛋白水平上进行验证，Serpin B1、annexinA3、Nm23-H1，APRT在不同分化胃癌组织中的表达结果均与蛋白质组学鉴定结果相符合，即Serpin B1、annexin A3在分化差的胃腺癌组织中表达增强；Nm23-H1、APRT则在分化好的胃腺癌组织中表达增强。这说明本研究的可信性较高，所得蛋白质点确与胃癌分化密切相关。2.对SerpinB1、annexin A3、Nm23-H1，APRT的分析显示，这些蛋白质在胃癌细胞信号传导、维持细胞形态及正常防御功能、促进细胞分裂增殖及细胞凋亡、侵袭转移等方面具有重要价值，并同时涉及胃癌的其他生物学特性，这些蛋白的表达与胃癌细胞分化类型的不同密切相关，进一步研究有可能找到关键的分化相关因子，通过干预这些因子的表达有可能抑制甚至逆转胃癌细胞的恶性分化，以其作为靶标开发治疗药物，将有望提高胃癌的治疗效果并改善预后。第四部分胃癌组织中Serpin B1的表达情况及其与胃癌临床生物学行为的关系目的：检测Serpin B1在胃腺癌组织与胃正常组织中的表达水平是否存在差异，分析Serpin B1在胃腺癌组织中的表达及其与临床生物学行为之间的关系，探讨Serpin B1在胃癌诊断、疗效监测、预后评价上的实用价值及其与肿瘤进展之间的内在联系并为进一步研究奠定基础，初步分析Serpin B1作为胃癌治疗靶点的可能性。方法：收集临床病理资料完整的80例胃腺癌组织作为实验组，40例胃正常组织作为对照组，参照2010版WHO胃肿瘤临床病理学分类及分期方法将临床病理资料分组，应用免疫组织化学方法检测胃腺癌组织与胃正常组织中Serpin B1的表达情况，用统计学软件SPSS13.0分析Serpin B1蛋白的表达与胃癌临床病理参数之间的关系。结果：1.Serpin B1在胃腺癌组织中的阳性表达率71.25%，而正常组织表达率为15%，两组之间有显著差异（P<0.01）。2.胃癌组织中SerpinB1蛋白表达与患者的年龄、性别、肿瘤大小、部位、是否远处转移等均无明显关系（P>0.05），但与肿瘤的浸润深度、分化程度、淋巴结转移及临床分期等关系密切（P <0.01或0.05）。结论：1. Serpin B1蛋白在胃腺癌组织中的阳性表达率明显高于正常胃组织，说明Serpin B1在胃癌中的表达具有一定的特异性，可作为胃癌的肿瘤标志物进一步开展临床研究。2. Serpin B1蛋白表达与肿瘤的浸润深度、分化程度、淋巴结转移、临床分期、脉管瘤栓等关系密切，提示Serpin B1阳性表达可能与肿瘤的侵袭、转移等特性有关，Serpin B1参与的某些功能可能加速了病情的进展，干扰Serpin B1的表达有望作为胃癌靶向治疗的手段。第五部分Serpin B1对人胃癌细胞株侵袭能力影响的机制研究目的：探讨Serpin B1在不同分化程度胃癌组织和细胞中的表达及对胃癌细胞侵袭能力的影响并对其相关机制进行分析。方法：蛋白印迹技术检测胃癌组织、癌旁正常组织及胃癌细胞株中Serpin B1表达情况；合成针对Serpin B1的siRNA并转染胃癌细胞株BGC823；细胞划痕实验及Transwell小室侵袭实验观察Serpin B1-siRNA转染BGC823胃癌细胞后对其侵袭和迁移活性的影响；检测转染前后侵袭和迁移相关蛋白MMP-2、MMP-9、ICAM-1及TIMP-1表达的变化。结果：1. Serpin B1在胃腺癌组织和细胞中的表达明显高于在癌旁正常组织中的表达，且随分化程度的降低而显著升高（P均<0.01）。2. SerpinB1-siRNA转染BGC823细胞株后对细胞株中Serpin B1表达有明显抑制作用，且抑制效果在剂量浓度为80nmol/l，作用时间为48小时最为明显。3.细胞划痕实验显示，Serpin B1-siRNA转染后（80nmol/l，48h）的BGC823细胞，修复划痕的能力在各时间点较Control组均明显降低（P均<0.01）。Transwell小室侵袭实验结果显示，Serpin B1-siRNA转染后的BGC823细胞，迁移到膜对侧的细胞数较Control组明显降低（P<0.01）。两实验均提示转染后的胃癌细胞株侵袭和迁移活性受到明显的抑制。4. SerpinB1-siRNA转染的胃癌细胞株BGC823经48h后，侵袭相关蛋白MMP-2、MMP-9、ICAM-1mRNA及蛋白表达和活性明显降低，而TIMP-1mRNA及蛋白表达则显著增加。结论：1. Serpin B1不仅在分化差的胃癌组织中的表达明显高于分化好的胃癌组织，在胃癌细胞株中也是如此，说明组织和细胞的同源性和相似性。2. Serpin B1-siRNA转染胃癌细胞BGC823后对其中Serpin B1蛋白表达有明显抑制作用，并可有效降低胃癌细胞的侵袭迁移能力。3. SerpinB1-siRNA转染胃癌细胞后致其侵袭迁移活力降低可能是通过下调ICAM-1、MMP-2、MMP-9，上调TIMP-1而发挥作用的。综合上述五部分内容，本研究小结如下：1.双向荧光差异凝胶电泳（2D-DIGE）结合LTQ离子阱型质谱仪，通过nanoESI-LC-MS/MS的分析方法进行蛋白质组学研究非常适合临床蛋白质标本的大规模的平行分离和分析，实验具有高度自动化、高通量、高灵敏度、结果准确、重复性好等优点，值得临床推广。但整体实验过程较复杂，专业性强，实验成本较高，临床研究中广泛应用仍需过程。2.实验证实不同分化程度的胃癌组织中蛋白表达确存在着明显差异，本研究从39个差异明显的蛋白质点中鉴定得到48种蛋白质，个别经质谱仪鉴定未得出数据的蛋白质点可能与实验过程中蛋白的磷酸化、甲基化等影响有关，去除结构蛋白及功能非特异性蛋白后确定6种可能与肿瘤分化有关的蛋白质，它们在不同分化程度的胃癌组织中表达各有不同。应用qRT-PCR及Western blot法对其中4种进行验证，所得结果与蛋白质组学结果符合，说明本研究的可信性较高，鉴定出的蛋白质点确与胃癌分化密切相关。3.分化相关蛋白Serpin B1、annexin A3在分化差的胃腺癌组织中表达增强，而APRT、Nm23-H1、GST-π-1、Dermcidin-lL则在分化好的胃腺癌中表达增强，初步分析这些蛋白质在胃癌细胞信号传导、维持细胞形态及正常防御功能、促进细胞分裂增殖及细胞凋亡、侵袭转移等方面具有重要价值，并同时涉及胃癌的其他生物学特性，这些蛋白的表达与胃癌细胞分化类型的不同密切相关，进一步研究有可能找到关键的分化相关因子，通过干预这些因子的表达有可能抑制甚至逆转胃癌细胞的恶性分化，以其作为靶标开发治疗药物，将有望提高胃癌的治疗效果并改善预后。4. Serpin B1蛋白在胃腺癌组织中的阳性表达率明显高于正常胃组织，说明Serpin B1在胃癌中的表达具有一定的特异性，可作为胃癌的肿瘤标志物进一步开展临床研究。Serpin B1蛋白表达与患者性别、年龄、肿瘤大小、部位、是否远处转移等无明显相关性，而与肿瘤的浸润深度、分化程度、淋巴结转移、临床分期、脉管瘤栓等关系密切，提示SerpinB1阳性表达可能与肿瘤的侵袭、转移等特性有关，Serpin B1参与的某些功能可能加速了病情的进展，干扰Serpin B1的表达有望作为胃癌靶向治疗的靶标。5.应用qRT-PCR及Western blot法对Serpin B1在不同分化程度胃癌细胞株（BGC823、SGC7901、MKN28）中的表达进行验证，结果进一步说明了Serpin B1在胃癌组织和细胞中表达的一致性，其在分化程度差的组织和细胞中的表达均明显升高，可作为胃癌诊断及分化判断的特异蛋白质。6. Serpin B1-siRNA转染胃癌细胞BGC823后对其中Serpin B1蛋白表达有明显抑制作用，并可有效降低胃癌细胞的侵袭迁移能力，虽然该研究尚处于初步阶段，但在一定程度上预示了其临床实用价值，以此作为治疗手段有可能抑制胃癌的恶性行为，提高患者生存期。7. Serpin B1-siRNA转染胃癌细胞后致其侵袭迁移活力降低可能是通过调节金属基质蛋白酶MMP-2、MMP-9及其抑制剂TIMP-1之间的平衡、干扰细胞间粘附分子ICAM-1而发挥作用的，确切的机制仍需进一步研究。