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猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible Gastroenteritis Virus, TGEV)和猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus, PEDV)是引起猪腹泻的重要病原。给养猪业带来严重的经济损失,目前疫苗免疫仍是预防这两种病的主要手段。实验从北京地区有严重腹泻症状的断奶仔猪粪便样品中,分离得到一株PEDV流行株,命名为LZW。通过免疫荧光,电镜观察,证实该株目前可以适应Vero细胞并在其中连续增殖,LZW和其适应株(24代)全基因组比较分析发现,它们均为28,038bp,与PEDV BJ-2011-1株核苷酸同源性均为99.7%。LZW和其适应株之间存在7个非同义突变,可能与PEDV体外生长适应相关。遗传进化分析表明,LZW和BJ-2011-1及新近出现的美国株形成一个G2a聚簇。该研究揭示了临床流行毒株信息,也为PEDV体外适应细胞培养的分子特性提供重要信息。其次,实验通过原核表达系统表达TGEV S基因不同编码区,以鉴定不同编码区表达产物与TGEV抗体的结合能力。在对TGEVS蛋白抗原位点分析的基础上,针对S蛋白N端的四个抗原位点C、B、D和A,设计引物分别扩增含C、B位点的TCB片段(411bp)、含D位点的TD片段(441bp)和含A位点的TA片段(456bp),经克隆测序后分别插入原核表达载体pET-32a中进行表达,SDS-PAGE电泳显示各片段均高效表达,表达的TCB片段、TD片段和TA片段融合蛋白大小分别为34.6kDa、35.1kDa和36.1kDa。Western blot结果显示表达蛋白与TGEV感染猪阳性血清和His标签抗体均产生阳性反应。本试验结果提示3个S基因编码片段均具有与TGEV抗体结合的能力,为后续夹心ELISA定量分析TGEV-PEDV转基因玉米目的蛋白表达量方法的建立奠定基础。利用转基因植物生产动物或人基因工程疫苗用于疾病的预防及治疗已成为植物基因工程的一个新兴研究领域。针对近几年猪病毒腹泻病的发病情况、流行株序列特点,本实验将TGEVS蛋白和PEDVS蛋白主要抗原位点编码基因串联成融合基因并导入玉米基因组中构建转基因玉米口服疫苗。实验根据国内外最新的保护性抗原位点研究进展及玉米中高表达蛋白的密码子偏好性进行优化,人工合成2.2kb的融合基因,获得的目的片段分别插入到CaMV E35S启动子(花椰菜花叶病毒启动子,组成型表达)和玉米Zein启动子(玉米醇溶蛋白启动子,胚乳特异性表达)下游,与启动子相连后,相应片段分别与表达载体pBAC9075A和pBAC9077A相连,获得表达质粒pBAC9089A,pBAC9090A, pBAC9092A和pBAC9093A。构建成功的表达质粒通过基因枪转化法和农杆菌介导转化法对玉米自交系501的幼胚和愈伤组织进行转化,转化后的愈伤组织经诱导、分化、壮苗后,分别获得含pBAC9089A的再生植株38株,含pBAC9090A的再生植株255株,含pBAC9092A的再生植株17株,含PBAC9093A的再生植株36株。经过田间草甘膦抗性筛选后,共获得7个T1代转基因玉米株系。通过PCR和Western初步鉴定结果显示,目的基因已成功整合到玉米基因组中并进行了表达。本研究获得的转基因玉米为TGEV-PEDV转基因植物疫苗研究奠定了基础。