论文部分内容阅读
苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）是一种生物杀虫剂,它的特点是高效且杀虫谱广,它的杀虫特性主要取决于在芽胞期产生的大量杀虫晶体蛋白（Insecticidal Crystal Proteins,ICPs）。目前,分子伴侣对芽胞杆菌中cry基因的影响主要集中于P19、P20、ORF1和ORF2的研究上,而groel、groes基因对cry基因的调控作用还不确定。本研究对Bt4.0718菌株-营养期（T1）,芽胞形成早期（T2）,芽胞形成中期（T3）和芽胞形成晚期（T4）的GroEL和GroES进行了免疫印迹分析,构建了重组表达质粒pET28a-GroEL和pET28a-GroES并转化E.coli BL21（DE3）,成功得到 GroEL 和 GroES 融合蛋白,HisTrap 亲和色谱纯化融合蛋白,免疫兔子制备多克隆抗体,western blotting分析显示,在四个时期都检测到了 60KDa的GroEL和10 KDa的GroES蛋白,GroEL和GroES蛋白在菌株培养10h即有表达,20h达到高峰,而后逐渐减弱,并且GroEL和GroES蛋白的表达丰度明显低于内参蛋白30s核糖体蛋白的表达丰度。本文运用基因重组技术敲除了苏云金芽胞杆菌KCTF12菌株中的groel基因,构建了groel基因缺失突变株,通过相差显微镜观察结果显示,与原始菌株KCTF12相比,groel基因的缺失导致菌株的生长明显延迟,形成的伴胞晶体蛋白变小,说明groel基因对菌株的生长有重要的意义,而且其在伴胞晶体的形成过程中发挥一定的作用。为了进一步研究GroEL、GroES与伴胞晶体蛋白形成的相关性,本研究以Bt融合基因工程菌XBU001（1Ac-GFP）为研究对象,利用激光共聚焦扫描显微镜、多克隆抗体和荧光染料偶联的二抗对GroEL和GroES在细胞中的定位进行了连续时间段的观察。结果发现,细胞内GroEL、GroES蛋白的红色荧光信号明显,并且与晶体蛋白的绿色荧光信号出现重叠,在菌株生长的10-25h,红色荧光随着绿色荧光的增强而增强,25-35h绿色荧光继续增强直到达到最高峰,而红色荧光逐渐减弱,35-55h绿色荧光强度保持稳定,此时并未检测到红色荧光,上述结果表明,在Bt菌株体内GroEL、GroES蛋白与伴胞晶体蛋白可能发生了直接或间接的相互作用。采用生物信息学手段对GroEL、GroES蛋白相互作用蛋白进行了预测,发现在Bt细胞内与GroEL蛋白相互作用的蛋白主要有Gros、DnaK、Tuf、BT97272551、BT97274829、HrcA、FtsH、GrpE和SecA1,与GroES直接作用的蛋白主要有Grol、DnaK、FtsH、AcpP、BT97270237、RpsM、GrpE、BT97274313、GuaA 和 NrdR。本文首次利用免疫荧光技术研究Bt细胞内伴侣蛋白与伴胞晶体蛋白之间的定位关系,为深入研究Bt体内伴胞晶体蛋白的形成过程、各代谢物之间的相互作用积累了有价值的实验资料。