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目的 视网膜色素上皮细胞（RPE）的吞噬功能对维持正常视觉功能至关重要；该功能障碍时引起视细胞外节盘膜的堆积而导致严重的视网膜变性。目前对该细胞的吞噬机理至今尚未十分清楚，进一步探讨吞噬功能及其机制，将对这类疾病的预防和治疗带来希望。 目前虽已知RPE细胞的特异性吞噬功能，涉及腺体-受体相互作用，启动跨膜信号传导系统，但是关于跨膜信号传导系统在RPE细胞特异性吞噬过程中所起的作用仍不十分清楚。为此我们选择信号传导通路中的一个第二信使分子cAMP作为研究对象，模拟在体条件下正常人RPE（HRPE）细胞的吞噬条件，在动态观察其特异性及非特异性吞噬的动力学特点的基础上，连续检测HRPE细胞不同吞噬阶段cAMP浓度的变化，探究HRPE细胞的吞噬功能与cAMP的关系。 材料与方法 1．材料来源 取自中国医科大学附属一院眼科角膜移植术后的正常人眼球，眼球供体年龄限制在24—38岁。 2．HRPE细胞的培养及标记 采用胰蛋白酶消化法。用含有终浓度为40ug／mlSR的生长液孵育第3～5代生长至90％融和的HRPE细胞36小时。 3．ROS的提取及FITC标记 室温下，于暗处用终浓度为10ug／ml的FITC液孵育以蔗糖密度梯度法提取的ROS1小时，然后以细胞培养液调整浓度为1×107ml-1 4．乳胶微球的制备 以细胞培养液调整浓度至1×107ml-1。 5．吞噬动力学观察 向每个培养孔K孔板)中加入1×107ml-1的 FITC－ROS或LB悬液Zrnl，进行孵育。分别在孵育sndnJ5minJ0ndn＊．sh。3h、6h、12h、18h在4h、36h、48h的时候，将孵育液吸出，以 4℃的无血清＊＊＊M冲洗二次，以终止吞噬。采用双重荧光标记法，于上述相应的实验时间点，在荧光显微镜下以非选择性滤光片动态观察HRPE细胞的吞噬过程。 6．扫描及透射电镜 经与ROS或LB孵育6h后，加人2．5％的戊二醛固定，备电镜观察。 7．细胞内CAMP浓度的检测 实验组每个培养子（24 IL板）中力人 IX 10’ml－‘的 ROS或 LB悬液IInl，对照组加人培养液Inil／孔进行孵育，终止吞噬的时间及方法同上。向终止反应后的HRPE细胞中加人无血清DMEM液pH7．4乃00W孔，立即放人沸水中煮沸 3 dn。从每个孔中取上清液100ul备‘勺一队MP放射免疫检测。 8．统计学分析结果 每个实验点至少重复3次，计算均值上标准差k土S人用Student’s t检验，比较实验组与对照组数值，P＜0．05为统计学上有明显差异的标准。 结 果 一月RPE细胞吞噬动力学检测结果： ·2· 1．特异性吞噬： 孵育15min时，即观察到ROS结合于HRPE细胞表面，30ndn时可见极少数的ROS被HRPE细胞摄人细胞内，之后的孵育过程中HRPE细胞结合及吞噬的ROS数目不断增加，至孵育18h和24h刀RPE细胞对ROS的结合及吞噬分别达到饱和。 2．非特异性吞噬： 孵育至1．sh结合启动，6h摄人开始，在观察的48h内HRPE细胞结合及吞噬的LB数目随时间延长而呈线性增加。 二、吞噬不同阶段 HRPE细胞内 cAMP浓度hmol·Inl1)检测结果： 1．特异性吞噬： 孵育 15min时 HRPE细胞内 cAMP浓度开始降低门．13。0．17八P＜0．05人在15min－18h内各个时间点的c＊＊P浓度无差异（P＞0．05），孵育 24hCAMP浓度再次降低，24h－36h内 CAMP浓度无差异冲＞0．05人 48 h CAMP浓度值略有回升。 2．非特异性吞噬： 与 LB孵育的 smin—12llHRPE细胞内 cAMP浓度与对照组无差异（P＞0．05），12h一8h C。4MP浓度较对照组降低（P＜0．05）。 结 论 1．HRPE细胞特异性吞噬过程中结合及吞人的启动早于非特异性吞噬。 2．HRPE细胞特异性吞噬的结合及吞人均具有饱和性，非特异性吞噬无饱和性。 3．CAMP对HRPE细胞特异性吞噬吞人过程的维持致关重要，但不参与非特异性吞噬的直接调节。 4．HRPE的特异性吞噬过程伴随着CAMP浓度的降低。