论文部分内容阅读
目的:WHV感染的Woodchuck肝炎模型被广泛用于研究HBV感染的发病机理。脂肪酸代谢在HBV感染进程中扮演重要角色。土拨鼠脂质代谢相关基因APN、APNRs、PPARα的序列目前尚未见报道。本研究对土拨鼠脂质代谢相关分子APN、APNR2及PPARα进行了克隆和序列分析,分别从体内和体外两个角度研究了脂肪酸代谢对HBV清除的影响及可能机制。方法:1、以地松鼠APN、APNR2、PPARαmRNA序列为模板设计引物克隆了土拨鼠APN基因编码区全长序列、PPARα部分序列及APNR2部分序列,DNAMAN和MEGA软件分析了其与人及其他哺乳动物的上述分子的同源性,RT-qPCR检测上述三个分子不同组织中的表达量。2、土拨鼠原代肝细胞接种WHV后,给予不同浓度二甲双胍处理,ELISA方法检测上清中的WHsAg、PCR检测WHVDNA,RT-qPCR检测PPARα、APNR2表达量,分析上述基因表达变化与病毒复制水平之间的关系。3、将120只C57BL/6雄性小鼠通过尾静脉注射pAAVHBV1.2质粒后随机分为健康饮食+生理盐水组(NS)、健康饮食+二甲双胍组(Met)、健康饮食+罗格列酮组(Rosig)、高脂饮食+生理盐水组(HF+NS)、高脂饮食+二甲双胍组(HF+Met)、高脂饮食+罗格列酮组(HF+Rosig)。分别给予健康或高脂饮食,同时给予或不给予二甲双胍或罗格列酮处理。ELISA检测血清中HBsAg、HBeAg的含量;肝组织内HBcAg的检测采用免疫组化法;PCR检测血清中HBVDNA的含量;RT-qPCR检测肝组织中AMPKα1、AMPKα2、PPARα、PPARγ、APN、APNR2、ACC1、CPT1mRNA的表达。结果:1.获得土拨鼠APN基因编码区全长735bp,获得土拨鼠APNR2基因编码区部分序列448bp,获得土拨鼠PPARα基因编码区部分序列469bp。土拨鼠APN序列与人APN序列同源性为89.39%;土拨鼠APNR2序列与人APNR2序列同源性为95.09;土拨鼠PPARα序列与人PPARα序列同源性为89.34%,与地松鼠PPARα序列同源性为99.15%。2.土拨鼠APN、土拨鼠APNR2在不同组织间表达量存在明显差异。APN在脂肪组织表达最高,APNR2在各组织中广泛表达,PPARα在肝组织表达最高。3.WPH中PPARα表达量随二甲双胍浓度增加而降低,上清中WHsAg、WHVDNA含量随二甲双胍浓度增加而下降。4.HBV质粒高压水注射后第42天,HF+Met组和HF+Rosig组血清HBsAg和HBVDNA水平、肝内HBcAg表达明显低于NS组和HF+NS组。5.肝内ACC1表达随HBsAg滴度下降而降低。CPT1表达随HBsAg滴度下降而升高。结论:1.获得土拨鼠APN全长序列、APNR2、PPARα部分序列。2.体内外研究发现:脂肪酸代谢调节药物二甲双胍和罗格列酮促进HBV的清除,脂代谢相关分子APN、APNR2、ACC1、CPT1、PPARα可能在其中发挥重要作用。这些数据将为进一步研究脂代谢在HBV感染中的作用提供重要的实验依据。