镉（Cd）是我国近海典型的重金属污染物之一,贝类一般通过水环境和摄食途径在体内积累Cd。相较于其他水生生物,贝类可以对Cd超富集,导致贝类产品不合格的因素主要是Cd超标。本论文旨在研究Cd胁迫下厚壳贻贝体内抗氧化应激及组织形态学变化、金属离子内稳态平衡的变化、Cd赋存形态的变化规律及蛋白组的变化,进而阐释厚壳贻贝中Cd的毒理学机制及富集机理,从而为Cd的风险评估和贝类食品安全容量的确定提供依据。通过一系列研究,所得结论如下:1.Cd胁迫下厚壳贻贝氧化应激及组织形态学变化通过分析Cd胁迫30d后各组织中抗氧化应激酶和MDA含量的变化发现,各胁迫部位的酶活性或含量与胁迫浓度不是单一的剂量-效应关系。各胁迫组性腺中GSH-Px的酶活性无显著性变化（p＞0.05）,推测有可能在厚壳贻贝中Cd通过影响性腺的血管系统而对其产生毒性。鳃中GSH-Px的酶活性呈现单一剂量-效应关系,胁迫浓度越高,酶活性越低（p＜0.01）。高浓度胁迫组血液中GSH-Px的酶活性被抑制（p＜0.01）,但肾脏中GSH-Px的酶活性显著升高（p＜0.01）。GST在性腺、鳃和肾脏中的含量随胁迫浓度的升高呈现先升高后降低的趋势,GST的含量变化在性腺中最为敏感,在消化腺中的含量随胁迫浓度的升高而显著升高。对CAT而言,不同胁迫组消化腺中的酶活性远高于其他部位中的酶活性,在高浓度胁迫组和最高浓度胁迫组消化腺中的酶活性显著降低（p＜0.05）,但在鳃中显著升高（p＜0.01）。性腺中MDA的活性显著高于其他胁迫部位（p＜0.05）。高浓度胁迫组消化腺和肾脏中MDA的活性随胁迫浓度的升高而升高,说明在这两个胁迫部位中脂质过氧化的程度随胁迫浓度的升高而越发严重,细胞的损伤程度也越高。但在鳃中,高浓度胁迫组和最高胁迫组中MDA的活性显著低于对照组（p＜0.05）,低浓度和中浓度胁迫组中MDA的活性高于对照组（p＜0.05）,有可能是因为Cd的胁迫对这一胁迫部位的脂质过氧化损伤在胁迫30 d时已恢复到正常水平。同时,SPSS双因素方差分析显示胁迫浓度、胁迫部位和胁迫浓度×胁迫部位交互作用对CAT的活性、GST和MDA的活性均有极显著影响（p＜0.01）。GST活性在不同胁迫浓度、不同胁迫组织间几乎均有极显著性差异（p＜0.01）,说明厚壳贻贝体内GST的活性对Cd的胁迫非常敏感。由此可知,Cd胁迫使各组织中的抗氧化酶活性或含量均发生变化,说明在组织中发生了不同程度的氧化损伤。不同胁迫浓度对不同部位产生的抗氧化损伤是不同的。从GST的酶活性变化中可以看出,消化腺和肾脏表现出趋于一致的应对抗氧化损伤的机制,而性腺和鳃也表现出相似的应对抗氧化损伤的反应。其中脂质过氧化损伤在各个部位中比较突出,绝大部分胁迫组与对照组相比均有显著性或极显著性差异,且有可能消化腺和肾脏显现出相同的应对脂质过氧化损伤的机制,性腺和鳃表现出相似的对应脂质过氧化损伤的反应。鳃中GST与Cd水平呈负相关,在消化腺中,GST与Cd的含量是单一剂量-效应关系,揭示了组织之间的补偿机制,以保护细胞免受氧化损伤。从总体来看,鳃中抗氧化应激酶的反应性更强,这与鳃作为与水环境直接的器官有关。从组织形态学分析来看,Cd的胁迫会使鳃出现空泡化,结缔组织出现萎缩、变小的现象,细胞中有固缩核出现。性腺中出现上皮细胞层缩小,空泡化严重,细胞数量减少,组织出现稀疏现象。鳃和性腺细胞中都出现血细胞浸润现象,说明在两个组织中均出现炎症。这一分析结果表明,Cd的胁迫使性腺和鳃的组织形态发生改变,不利于生物体的生存,但不同胁迫浓度使之发生改变的程度不尽相同。2.Cd胁迫下厚壳贻贝各组织中金属元素内稳态平衡变化机制在每个胁迫组中,鳃是对Cd胁迫首先响应的组织,足和外套膜对Cd胁迫的响应要快于内脏,性腺是和肌肉是响应最慢的组织。在胁迫期间,胁迫前期（10d前）,在低浓度和中浓度胁迫组中,鳃的Cd累积高于内脏,但在高浓度和最高浓度胁迫组中,内脏和鳃的累积量相当;在胁迫后期（20 d后）,四组胁迫组中,内脏和鳃的Cd累积量高于其他组织,但两者间Cd累积量是交替变化的。此外,在整个胁迫期间,性腺和肌肉的Cd累积量几乎一直低于其他组织部位。从生物富集系数（BCF）来看,在胁迫30 d时,其大小排序为:鳃＞内脏＞足＞外套膜＞性腺＞肌肉,这与各组织中Cd的积累量的排序基本一致。Cd的胁迫不仅改变了厚壳贻贝体内某些元素的含量,也改变了Se、Sr、Mn、Zn、Cu、Fe、Mg与其他元素间的相关性,而这些元素多为电负性且具有较低的还原电位和较强的电子亲和力,因此具有较强的抗氧化能力,可以降低Cd胁迫对机体产生的氧化应激损伤,这也可能是厚壳贻贝抵御Cd毒性的机制之一,而正因为降低了Cd对自身的损伤,贻贝才可以在体内富集Cd,且在高Cd负担下可以正常生活的原因之一。推测这也可能是造成贝类与其他水生生物（如鱼）在Cd富集能力方面差异的原因。3.Cd胁迫下厚壳贻贝各组织中Cd形态（无机离子Cd和有机结合Cd）的含量变化通过分析对照组和各胁迫组性腺、肌肉和外套膜中无机Cd离子的含量发现,Cd的胁迫会使上述三种组织中Cd2+的含量增加,但Cd2+的增加量与胁迫浓度不是单一的剂量-效应关系。从胁迫部位看,在整个胁迫周期内,低浓度胁迫组的性腺和肌肉中Cd2+的含量高于其他胁迫组（除最高浓度胁迫组）;外套膜中各胁迫组中Cd2+的含量变化无明显规律,但高浓度胁迫组中Cd2+的含量几乎一直低于其他胁迫组。从胁迫浓度看,在三种组织中,最高浓度胁迫组中Cd2+的含量变化规律一致,在胁迫15～30 d时,Cd2+的含量急剧上升后又急剧下降。在其他胁迫组中,低浓度的胁迫会使厚壳贻贝各组织中的Cd2+的含量升高,但随着胁迫浓度的增加,Cd2+的含量和比例没有继续升高,甚至低于低浓度胁迫Cd2+的含量或水平与其相当。分析对照组和各胁迫组性腺、肌肉和外套膜中无机Cd离子的占比发现,低浓度胁迫组的性腺和肌肉中Cd2+的占比高于对照组和其他胁迫组。外套膜（对照组）中Cd2+的占比甚至高于其他胁迫组。这说明随着Cd胁迫浓度的增高,其体内Cd2+的比例并没有随之升高,所以厚壳贻贝体内的有机Cd占比是随之升高的。因此,Cd在厚壳贻贝体内富集的机理之一是:一方面Cd与蛋白质或小分子物质结合后机体对其的吸收转运效率高,而且难以排出体外,造成Cd在体内的富集;另一方面,Cd与蛋白质或小分子物质结合后有可能会降低Cd对其造成的损伤,降低Cd的毒性,从而使Cd可以在厚壳贻贝体内超富集。采用两步柱层析法从虾夷扇贝内脏中提取金属结合蛋白（F1-2）。它在蛋白电泳中表现为一条单带,由于其自身结构原因在电泳中迁移异常,表现出高于自身的表观分子量。F1-2的氨基酸构成中半胱氨酸占氨基酸总量的三分之一。结合F1-2的上述两个特点,可以确定F1-2是一种MT。FTIR和CD结果表明,F1-2具有蛋白质二级结构特征。F1-2也具有良好的抗氧化活性。根据本研究建立的提取纯化工艺,可以从扇贝内脏中获得大量的MT。未来可以考虑规模化生产,一方面可以提高扇贝内脏的经济价值,另一方面也可以为有机镉检测提供定量依据,为Cd形态分析提供标准物质,但是从本研究得到的MT到其达到标准物质的要求还有一段路要走。4.Cd胁迫对性腺组织的毒理学作用机制以性腺为厚壳贻贝各组织的典型代表,从金属离子和蛋白质水平上研究了Cd胁迫对其的毒理学机制。与对照组相比,两个Cd处理组（高浓度组和最高浓度组）的厚壳贻贝性腺在金属含量（如K、Zn和Mn）、金属相关性（如Fe、Cu、Se、Mn、Zn、Sr和Mg）和蛋白质表达方面发生了显著改变。由于Cd的过度积累,贻贝性腺的元素组成发生了特征性的变化,具有抗氧化活性的金属离子的含量或金属离子间的相关性发生了改变。同时,高氧化应激干扰能量代谢过程,主要涉及TCA循环和氧化磷酸化,也导致细胞膜结构不稳定,部分氨基酸生物合成机制和蛋白质翻译过程受损。然而,在两个胁迫组中,金属含量和相关性的具体变化以及蛋白质水平的反应都不相似,这表明Cd对氧化应激抗性的剂量依赖性影响。这项研究证实,即使对于相同的组织,在不同程度的Cd胁迫下,贻贝体内启动的特定Cd解毒机制也不完全相同。本研究有助于更好地理解Cd的毒理学机制。综上所述,Cd胁迫使厚壳贻贝各组织中的抗氧化应激酶的活性或含量发生改变,而且这种改变在各组织中不尽相同,但GST在各组织中呈现单一的剂量-效应关系,但GSH-Px、CAT和MDA在各组织中未表现出单一的剂量-效应关系。Cd胁迫使鳃和性腺细胞出现空泡化、而且血细胞大量浸润,提示细胞中发生了炎症。Cd的胁迫使厚壳贻贝的TCA循环和氧化磷酸化等能量代谢过程、细胞膜结构、部分氨基酸生物合成机制和蛋白质翻译过程受损。因此,Cd对厚壳贻贝的毒性机制为破化细胞的组织结构、在体内产生氧化应激损伤、破坏其能量代谢过程、细胞膜结构的稳定、部分氨基酸的生物合成机制和使蛋白质翻译过程受损。Cd的胁迫破坏了金属离子的内稳态平衡,使具有抗氧化活性的相关金属离子的含量或相关性发生了变化,这种变化有可能会降低Cd的毒性。此外,Cd的胁迫使各组织中Cd的含量显著增长,但同时Cd2+在总Cd中的比例并未随之增加,这说明有机结合Cd的在总Cd中的比例增加。因此,厚壳贻贝可以超富集Cd的机理为:一方面,当胁迫于Cd时,机体的抗氧化酶发挥作用,具有抗氧化活性的金属离子的含量或相关性发生改变,Cd进入机体后多与蛋白质或小分子物质结合,上述三种都可能会降低Cd的毒性,使机体可以耐受高浓度的Cd;另一方面,Cd与蛋白质或小分子物质结合后机体对其的吸收转运效率高,可以快速将Cd固定在体内,而且难以排出体外,造成Cd在体内的富集。