论文部分内容阅读
GacS/GacA是保守的全局性双元调控系统，GacA(Activator)是配位因子，接受GacS的磷酸基团后被激活从而参与细菌次生代谢的调控。基因rhlI是信号分子N-丁酰高丝氨酸内酯(C4-HSL,BHL)、N-己酰高丝氨酸内酯(,C6-HSL,HHL)合成酶的编码基因。为了研究假单胞菌M18中GacA对高丝氨酸内酯类信号分子（AHLs）种类和产量的影响，分别从野生株M18和gacA基因突变株M18G的发酵液中提取信号分子，发现菌株M18至少合成5种AHLs：BHL、HHL、N-3-氧-己酰高丝氨酸内酯（3-Oxo-C6-HSL,OHHL）、N-3-氧-辛酰高丝氨酸内酯（3-Oxo-C8-HSL,OOHL）和N-3-氧-癸酰高丝氨酸内酯（3-Oxo-C10-HSL,ODHL）；突变株M18G中有4种AHLs：BHL、HHL、OOHL和ODHL，但与野生株M18相比积累量明显下降。KMB和PPM培养基中得到相同的实验结果，表明gacA基因正调控信号分子合成。通过转化rhlI基因翻译融合表达质粒pMEIZ至菌株M18和M18G中并进行β-半乳糖苷酶活性分析，发现在PPM和KMB培养基中，菌株M18（pMEIZ）的β-半乳糖苷酶活性要明显高于突变株M18G（pMEIZ），进一步表明GacA在基因表达水平上正调控rhlI基因的表达。
为了研究AHLs对吩嗪-1-羧酸（PCA）和藤黄绿菌素（Plt）合成调控的影响，利用同源重组方法对野生株中的rhlI基因进行定点突变，得到突变株M18RT。在突变株M18RT发酵液中无法检测到信号分子BHL和HHL，且测定PCA、Plt产量时发现rhlI基因突变后PCA的产量显著降低，Plt的产量则比野生株M18高出3倍。表明BHL和HHL对PCA合成具有正调控作用，对Plt合成具有负调控作用。通过信号分子添加实验，进一步验证了BHL和HHL对PCA、Plt产量的区别性调控。菌株M18中，PCA的合成主要受到GacA的负调控，且GacA的负调控大于BHL和HHL对PCA的正调控作用。而Plt合成是通过GacA的正调控与BHL、HHL的负调控共同起作用的，且GacA的正调控占主导地位。
测定PCA、Plt产量时，发现菌株M18和M18G在PPM和KMB培养基中的产量有明显差异，表明培养基成分影响次级代谢产物的产量。通过转化gacA基因翻译融合表达质粒pMEGZ至菌株M18和M18G并进行β-半乳糖苷酶活性分析，发现菌株M18（pMEGZ）和突变株M18G（pMEGZ）的β-半乳糖苷酶活性没有大的差别。表明培养基对PCA、Plt产量的影响并非通过影响gacA基因的表达量来实现的。