目的:自噬(autophagy)是当细胞状态为饥饿或应激时,细胞可通过自我消化胞内多余或反常的成分,进而得取养分以促使内环境处于稳态的过程,自噬在真核细胞生长发育过程中广泛存在,适度自噬,可促进蛋白质和细胞器的循环利用,并且对促使细胞功能正常和细胞存活有不可忽视的价值;但是,如果细胞自噬过度,细胞会出现吞噬自身的细胞器而死亡。现如今,有关自噬和程序性细胞死亡,分子生物和细胞生物学家的认知尚停留于初级水平。在国内,有关细胞自噬等方面的探索更为少见,且常常拘泥于其在肿瘤、心血管、神经退行性疾病变等方面的研究,尚未发现自噬与成骨细胞相关的研究。骨代谢过程中,激素调节、生长因子、神经系统与骨生长和骨吸收的全部调节过程,共同形成调节网络。雌激素对骨代谢和保持骨量正常等方面,具有调节作用。通过文献表明,雌激素匮乏使成骨细胞增殖异常,并使其功能受损。在人体诸多组织器官内,雌激素在调节生理、病理等方面意义巨大。雌激素受体α(estrogen receptorα,ERα)和雌激素受体β(estrogen receptor β,ERβ)是雌激素的主要受体,转录因子位于细胞核,会与雌激素反应元件相结合,进而对基因的表达进行调节。目前,随着分子克隆的发展,科学家们发现一种新型的G蛋白偶联雌激素受体(G protein-coupled estrogen receptor,GPER)。关于 GPER 的由来目前还不清楚,关于GPER是存在于细胞膜或内质网还是高尔基体内定位都各有其词。但在近些年有学者研究表明,GPER存在于某些肿瘤细胞纤维母细胞的细胞核中,这种纤维母细胞激活GPER受体。有研究表明GPER也是一种能够七次跨膜的G蛋白偶联受体,存在于机体内的各个系统中,如神经系统、免疫系统等,在系统中具有促进雌激素非基因组效应,对多种生物体进行非直接控制。若激活GPER,则会激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶 B(phosphatidylinositol 3 kinases/phosphorylated protein kinase B,PI3K/AKT)通路,在机体细胞中磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B的表达都是依靠GPER促进下进行。研究发现在多种癌症中都发现有GPER的过表达,例如在子宫内膜癌中的表达异常明显高于癌旁组织中的表达,前列腺癌和肺癌等也同样如此。AKT在GPER条件下激活,细胞增殖明显增强。GPER能够调节成骨细胞基因表达,因为GPER本身具有抗氧化作用。在骨代谢过程中,能够阻止骨量减退,但在骨量减退的情况下,破骨细胞会增加,在这个过程中PI3K-AKT-mTOR的表达会衰弱,并因为PI3K-AKT-mTOR失活,影响到丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)活性,致使细胞的自噬能力提高。诱导促进人骨髓间充质干细胞(Human mesenchymal stem cells,hMSCs)发生细胞成骨分化。PI3K/AKT是一种信号转导通路,能够参与细胞生长、发展、凋亡和自噬,它在细胞内分布广泛,有着极其重要的作用。在PI3K/AKT通路中,磷酸酶张力蛋白(phosphatase and tensin homolog,PTEN)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian targetofrapamycin,mTOR)是非常重要的分子。PI3K有Ⅰ型、Ⅱ型Ⅲ型,作用分别为抑制细胞自噬、与自噬关系不大的和可促进细胞自噬。目前研究认为,AKT活化降低,会产生自噬,阻碍细胞增殖,导致其凋亡。而在应激条件下,会致使AKT活化减少。研究发现,X线辐射能阻碍PI3K/AKT活性,使乳腺癌细胞自噬发生。研究还表明,咖啡因致使细胞凋亡时,产生许多自噬体,LC3 Ⅱ表达增多,AKT和p70S6K表达减少。这表示,PI3K/AKT信号通路调控蛋白表达可受到咖啡因的阻碍,导致细胞自噬后凋亡,被称为自噬性程序性死亡。mTOR是一种自噬关键酶,可以被激活参与PI3K/AKT信号通路表达,主要分为两种形式,即mTORC1和mTORC2。mTORC1不能够直接调节细胞自噬,mTORC2可由西罗莫司切断,调节自噬。mTOR在人体内的共同来源的基因有FRAP1,它们均可被Class Ⅰ、PI3K、MAPK等多种信号调控,当mTOR信号被细胞自噬的能力与细胞的营养程度干扰时,会受到这些因素影响可感受营养和能量转变。综合研究结果,我们认为,17β-雌二醇(17β-estrogen,17β-E2)可以通过调节成骨细胞线粒体自噬维持成骨细胞存活,并且抑制其凋亡。同时这种作用可能通过GPER,调节PI3K/AKT通路实现的。目前关于17β-E2是否通过GPER干预PI3K/AKT通路调节成骨细胞线粒体自噬的研究未见报道。因此,本研究将探究17β-E2抑制成骨细胞自噬,抑制其凋亡的作用机制,明确是否通过GPER介导;同时探讨17β-E2通过GPER对PI3K/AKT通路的调节作用,明确17β-E2通过GPER调节PI3K/AKT通路抑制成骨细胞自噬,抑制成骨细胞凋亡的作用,从而提高成骨细胞的存活率,为17β-E2临床应用提供更可靠的理论依据。研究方法:第一部分:17β-E2及GPER干预MC3T3-E1小鼠成骨细胞线粒体自噬的研究1、17β-E2对MC3T3-E1小鼠成骨细胞内GPER mRNA表达的影响研究MC3T3-E1小鼠成骨细胞,分别采用递增浓度17β-E2,如(0,10-9 M,10-8M,10-7 M,10-6 M)分别进行处理。然后测定小鼠成骨细胞中GPER mRNA表达,检测方法为:实时定量PCR。2、17β-E2对小鼠成骨细胞中GPER蛋白表达影响小鼠成骨细胞MC3T3-E1,分别应用不同浓度17β-E2(0,10-9 M,10-8M,10-7 M)和/或GPER抑制剂G15(15μM)进行处理,采用Western blot检测MC3T3-E1细胞中GPER蛋白表达与17β-E2浓度变化的关系。3、MC3T3-E1小鼠成骨细胞中GPER蛋白的表达采用免疫荧光染色分析4、17β-E2对MC3T3-E1细胞线粒体中自噬体的影响采用透射电子显微镜观察MC3T3-E1小鼠成骨细胞,应用17β-E2或GPER抑制剂G15处理,采用透射电子显微镜研究17β-E2对MC3T3-E1细胞自噬的形态变化的影响。5、17β-E2对MC3T3-E1小鼠成骨细胞中自噬溶酶体数量的影响,具体方法采用:免疫荧光双染法。第二部分:17β-E2通过GPER影响MC3T3-E1小鼠成骨细胞自噬相关蛋白活性的研究MC3T3-E1小鼠成骨细胞,应用17β-E2进行处理的同时,分别加入15μ M的G15(GPER特异性抑制剂)、20 μ M的LY294002(PI3K特异性抑制剂),检测MC3T3-E1小鼠成骨细胞中LC3-Ⅱ、TOM20和Hsβ60蛋白活性,具体操作方法为:Western blot。第三部分:17β-E2调节MC3T3-E1小鼠成骨细胞线粒体自噬的分子机制研究1、小鼠成骨细胞中Akt和mTOR蛋白活性与17β-E2相关性MC3T3-E1小鼠成骨细胞,应用17β-E2进行处理的同时,分别加入15μM的G15(GPER特异性抑制剂)、20 μM的LY294002(PI3K特异性抑制剂)以及0.1μM的mTOR特异性抑制剂进行处理,AKT和mTOR的蛋白活性通过Western blot检测。2、小鼠成骨细胞中β38蛋白活性与17β-E2相关性MC3T3-E1小鼠成骨细胞,应用17β-E2进行处理的同时,分别加入15μM的G15(GPER特异性抑制剂)、10μM的p38特异性抑制剂进行处理,p38的蛋白活性通过Western blot检测。3、小鼠成骨细胞中JNK蛋白活性与17β-E2相关性MC3T3-E1小鼠成骨细胞,应用17β-E2进行处理的同时,分别加入15μM的G15(GPER特异性抑制剂)、10 μM的JNK特异性抑制剂进行处理,JNK的蛋白活性通过Western blot检测。结果:第一部分:17β-E2及GPER对MC3T3-E1成骨细胞线粒体自噬的影响结果发现,与对照组相比,17β-E2能够增加细胞质内的GPER蛋白表达。17β-E2组MC3T3-E1细胞质中自噬小体明显减少。17β-E2能够下调TOM20与LAMP2,降低细胞质内线粒体的自噬溶酶体数量。在基因和蛋白表达水平上,17β-E2对GPER均具有刺激作用,并呈计量依赖性。在基因水平上,10-8M的17β-E2可以促进GPER mRNA的表达上调;而在蛋白水平上,10-7M的17β-E2可以促进GPER mRNA的表达上调。17β-E2的调节作用可被G15(GPER特异性抑制剂)所抑制。第二部分:17β-E2调节GPER蛋白对小鼠成骨细胞自噬相关性分析小鼠成骨细胞中LC3、TOM20和Hsp60蛋白表达检测,采用Westernblot方法分析,在浓度为10-7M时,17β-E2对小鼠成骨细胞中LC3-Ⅱ、TOM20和Hsp60蛋白活性的影响最为显著,LC3-Ⅱ可以显著降低,TOM20和Hsp60可显著升高,G15(15μM)及LY294002(20μM)两种抑制剂均可以有效阻断17β-E2调控LC3-Ⅱ、TOM20和Hsp60蛋白活性。第三部分:17β-E2调节MC3T3-E1成骨细胞线粒体自噬的分子机制的研究17β-E2能够促进细胞中Akt蛋白活性,G15(15μM)和LY294002(20 μM)均可以有效阻断17β-E2的作用。17β-E2能够促进细胞中mTOR蛋白活性。G15(15 μM)和mTOR特异性抑制剂(0.1μM)均可以有效阻断17β-E2的作用。上述结果表明,17β-E2通过PI3K-AKT-mTOR信号通路调节MC3T3-E1细胞的线粒体自噬。结果还发现,细胞经过17β-E2处理后,与对照组相比,p38蛋白活性和JNK蛋白活性未见明显改变。结果表明,17β-E2不能调节p38信号通路和JNK信号通路调节。结论:1、17β-E2能够剂量依赖性地增加MC3T3-E1成骨细胞GPER的表达活性。2、17β-E2能够抑制MC3T3-E1成骨细胞线粒体自噬。3、17β-E2通过调控GPER来影响PI3K-AKT-mTOR信号通路,从而抑制成骨细胞中线粒体自噬。4、17β-E2对细胞中p38和JNK蛋白活性无明显的影响。