知母-黄柏药对是中医常用来治疗糖尿病的经典药对。中药配伍可以改变药效物质进入体内的吸收及代谢过程,从而改变其作用途径和作用靶点,以达到增效减毒的目的。本文采用“四段式”研究方法,即对提取物、门静脉血(入肝前)、肝脏(主要的代谢和药效靶点器官)和外周血(出肝后)四部分进行定量分析和药动学考察,并结合体外肠道菌和原代肝细胞孵育实验,探讨知黄配伍前后药效成分在大鼠体内的代谢和药动过程变化,从代谢和药动角度侧面阐明知母黄柏单味及药对的药效物质基础和部分配伍机制。1.采用“四段式”策略研究知母药效物质基础建立了同时检测知母7种成分(包括3种口山酮类成分和4种皂苷类成分)的HPLC-MS/MS定量方法并对其进行方法学考察,然后将该方法用于知母“四段式”研究,其结果为:知母提取物的含量顺序为Timosaponin B2(1)>Mangiferin(0.33)>Timosaponin B3(0.24)>Neomangiferin(0.05)>Timosaponin A3(0.005);门静脉血中化合物的暴露量顺序为Mangiferin(1)>Norathyriol(0.38)>Timosaponin B2(0.29)>Timosaponin B3(0.22)>Timosaponin A3(0.13)>Neomangiferin(0.01),口山酮类原形成分Mangiferin及代谢物Norathyriol在门静脉血的暴露量很高,而Neomangiferin的暴露量最小,皂苷类成分Timosaponin B2、Timosaponin B3和Timosaponin A3也有一定的暴露量,由此可知门静脉血中各成分的暴露量顺序和它们在提取物中的含量顺序并不一致;肝脏中主要以Timosaponin A3和Norathyriol为主,尤其Timosaponin A3大量蓄积,Timosaponin A3(1)>Norathyriol(0.02);外周血中暴露量顺序变为Mangiferin(1)>Timosaponin B2(0.15)>Timosaponin B3(0.10)>Norathyriol(0.09)>Timosaponin A3(0.08)>Neomangiferin(0.01),可知药材含量较低的Mangiferin暴露量最高。结合上述“四段式”研究结果及体外的肠道菌和原代肝细胞的代谢结果,可以推测知母成分的大鼠体内过程:提取物中含量最高的皂苷类成分Timosaponin B2、Timosaponin B3在门静脉和外周血中都保持一定的暴露量,其肝脏提取率分别为67.5%和70.4%,表明皂苷类原形成分的肝脏首过效应比较严重,但体内外实验证明Timosaponin B2和Timosaponin B3在肝脏中既不代谢也不蓄积,因此推测皂苷类肝首过效应可能与肝脏消除(如胆汁外排)有关;大鼠体内的Timosaponin A3主要是由知母中的皂苷类原形成分(如Timosaponin B2、Timosaponin B3)在肠道菌作用下代谢产生,并且在肝脏中存在大量蓄积;门静脉血和外周血中暴露量最高的mangiferin主要来自于提取物中的mangiferin原形,还有一部分来自于neomangiferin的代谢,肝脏对mangiferin的提取率为35.6%,但mangiferin既不在肝脏中蓄积也不发生肝脏代谢,推测门静脉血中的mangiferin大部分进入到体循环,另一部分可能通过肝脏消除排出体外;体内的口山酮类代谢物norathyriol是由mangiferin和neomangiferin在肠道菌作用下代谢而来,并且在肝脏中存在蓄积。2.采用“四段式”策略系统研究黄柏药效物质基础建立了同时检测黄柏八个成分的hplc-ms/ms定量方法(包括3种生物碱原形和5种berberine代谢物)并对其进行方法学考察,然后将该方法用于黄柏的“四段式”研究,结果发现:黄柏提取物主要以berberine、phellodendrine、magnoflorine这三种生物碱为主,berberine(1)>phellodendrine(0.23)>magnoflorine(0.15);其他五种berberine的代谢物成分在药材中含量非常低,均低berberine含量的5%;门静脉血的暴露量顺序为magnoflorine(1)>phellodendrine(0.74)>berberine(0.46)>berberrubine(0.12)>thalifendine(0.05),可知大鼠经口服吸收,进入门静脉血的化合物暴露量顺序与提取物并不一致;肝脏中,各成分的暴露量顺序较门静脉血变化显著,berberine(1)>berberrubine(0.96)>thalifendine(0.87)>jatrorrhizine(0.68)>magnoflorine(0.57)>phellodendrine(0.55)>demethyleneberberine(0.12)>columbamine(0.08),berberine的肝脏暴露量最多,其次为其代谢物berberrubine、thalifendine、jatrorrhizine;外周血中,magnoflorine的暴露量最高,暴露量顺序为magnoflorine(1)>berberine(0.25)>thalifendine(0.09)>berberrubine(0.07)>phellodendrine(0.05)。结合上述“四段式”研究结果及体外的肠道菌和原代肝细胞的代谢结果,可以推测黄柏成分的大鼠体内过程:phellodendrine在门静脉血中有一定的暴露,其肝脏提取率为96.1%,表明肝脏对phellodendrine存在很强的首过效应,这与phellodendrine在肝脏中的蓄积,且存在的肝脏代谢有关;magnoflorine在门静脉-肝脏-外周血中均存在一定的暴露,其肝脏提取率为47.5%,这可能与magnoflorine在肝脏中存在的蓄积有关,而magnoflorine并不在肝脏中代谢;berberine在门静脉血、外周血和肝脏中均有一定量的暴露,其肝脏提取率为71.5%,表明肝脏对berberine存在较强的首过效应,这与体外实验中检测到berberine经肠道菌和肝脏的作用下发生广泛的代谢相关,且代谢过程中生成了berberrubine、thalifendine、demethyleneberberine、jatrorrhizine、columbamine五个代谢物。这些代谢物都在肝脏存在较大的暴露,另外代谢物berberrubine、thalifendine在门静脉血和外周血中也可以检测到。以上实验分别采用“四段式”中药及复方药效物质研究策略对知母和黄柏提取物中的药效成分群在体内外进行系统研究。因此,通过“四段式”可以较全面、系统地阐述知母和黄柏中主要成分(包括原形和代谢物)的体内动态过程,从代谢和药动学角度侧面阐明单味知母和黄柏的药效物质基础,为后续研究知母黄柏药对的药效物质基础和配伍机制奠定基础。3.采用“四段式”策略系统研究知母黄柏药对配伍机制通过比较知母黄柏单味组及配伍组的“四段式”结果发现,知母黄柏单煎与合煎后的提取物中各成分未见明显的变化。然而经大鼠口服后,与黄柏的配伍会导致知母皂苷类成分在门静脉血和外周血中的暴露量显著改变,其中timosaponinb2分别提高了67%和149%,timosaponinb3分别降低了41%和29%,timosaponina3分别降低了51%和22%,而timosaponina3在肝脏中的蓄积量增加了57%;知母口山酮类成分在门静脉血和外周血中的暴露量皆有所下降,neomangiferin分别降低了40%和23%,mangiferin分别降低了54%和58%,norathyriol均降低了82%左右,而norathyriol在肝脏中的暴露量却提高了198%。另一方面,知母的存在,使得生物碱类成分phellodendrine、magnoflorine和berberine在门静脉血-肝脏-外周血中的暴露量都有显著上升:phellodendrine分别提高了64%、181%和195%,magnoflorine分别提高了110%、31%和67%,berberine分别提高了234%、233%和169%。此外,berberine代谢物berberrubine、thalifendine在门静脉血和外周血中暴露量也显著升高,并且thalifendine、demethyleneberberine、columbamine在肝脏中的蓄积量也均有增多,推测知母中的成分可以与黄柏中的成分发生代谢酶或者转运体的药物相互作用,从而导致上述化合物体内暴露量的改变。采用“四段式”中药及复方药效物质研究策略,对知母黄柏单味及配伍的主要原形成分及代谢物成分进行了体内外含量及暴露量比较,结果表明配伍煎煮过程对知母黄柏中药效成分的含量影响较小,但配伍对大鼠口服后的体内原形成分和代谢物成分的药动学影响比较显著,包括口山酮类成分在入肝前后血中的暴露量皆降低,而生物碱类成分却均升高,皂苷类成分timosaponinb2在入肝前后血中的暴露量增多,而timospaoninb3的暴露量却减少,特别值得注意的是肝脏内口山酮类、皂苷类及生物碱类代谢物的暴露量均有不同程度的提高。结合化合物的药理报道,体内多成分代谢及动力学特征的变化规律和差异,推测知母黄柏的配伍机制可能除了提高原形成分如黄柏中降糖生物碱类成分magnoflorine、berberine进入体内血液及肝脏的量,更重要的是还可以提高知上海师范大学硕士学位论文摘要母中的代谢物Timosapanin A3、Norathyriol和黄柏中Berberine代谢产物进入肝脏的量,从而起到增强药效的作用。