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由于三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer,TNBC）缺乏有效的治疗靶点,手术治疗和传统化疗是其最主要的治疗方式,但仍表现出较高的复发率和死亡率。免疫治疗是一种具有潜力的治疗方式,但单独应用于TNBC的治疗效果有限。化学免疫疗法是应用了化疗药物的细胞毒性作用和免疫调节作用,联合免疫治疗策略协同抗肿瘤的一种治疗方式,具有广泛应用前景。然而,提高协同治疗的疗效并减少多种药物的副作用仍然是化学免疫疗法面临的主要挑战。在过去的几十年里,药物递送系统的出现是解决这一问题最有潜力的策略之一。将药物递送系统作为化学免疫治疗的载体可以延长药物的半衰期、增加药物累积、靶向递送药物至特定靶点,从而最大限度地减少对非靶组织的影响,为TNBC的化学免疫治疗提供了更精确和更有针对性治疗模式。活细胞可作为具有高度特异性和持久性的新型疗法和药物载体。通常利用物理、化学和材料方法将治疗药物负载到细胞内或固定在细胞膜表面,赋予细胞新的治疗功能。既往研究中发现通过在液氮中快速冷冻活肿瘤细胞制备的“死细胞”保留了源细胞的主要结构和向病变部位的趋化性,但失去了增殖能力和致病性,使它们成为了理想的药物载体。此外,由于细胞表面蛋白和肿瘤相关抗原（tumor associated antigens,TAAs）等被完整保存在细胞中,使经液氮处理后的细胞可以作为肿瘤疫苗,激活并诱导树突状细胞（dendritic cell,DC）成熟,促进抗肿瘤特异性免疫反应。当肿瘤细胞受到外界刺激发生死亡的同时,由非免疫原性转变为免疫原性而介导机体产生抗肿瘤免疫应答的过程被称为免疫原性死亡（immunogenic cell death,ICD）。在ICD引发的适应性免疫反应和质膜通透的过程中,垂死的肿瘤细胞释放多种损伤相关分子模式（damage associated molecular patterns,DAMPs）,他们与DC等抗原提呈细胞上的模式识别受体结合,激活DC成熟并吞噬肿瘤抗原,随后将其呈递给T淋巴细胞,从而使免疫活性宿主在没有任何佐剂的情况下可以引发针对死亡细胞相关抗原的特异性免疫反应。传统化疗药物不仅可以诱导肿瘤细胞凋亡,还可以通过诱导ICD促进肿瘤特异性免疫反应或消除免疫抑制性肿瘤微环境等机制发挥免疫调节作用,增强肿瘤细胞的佐剂性。此外,化疗的免疫调节作用可与免疫检查点阻断疗法相结合,共同促进DC的趋化,进而增强免疫治疗的活性。基于上述内容,本课题设计了经液氮冷冻制备（liquid nitrogen-treated,LNT）细胞,将其作为载体负载了具有ICD诱导作用的化疗药物紫杉醇（paclitaxel,PTX）,制备了具有免疫刺激能力的细胞载药系统（PTX@LNT）,并探究了其在肿瘤治疗和预防中的潜在应用和作用机制。此外,我们设计了PTX@LNT细胞载药系统与程序性死亡配体1（programmed cell death-ligand 1,PD-L1）抑制剂的联合治疗策略,探究了联合治疗对转移性肿瘤的治疗效果,实现了化疗和免疫治疗的协同治疗。本研究分为两个部分:第一部分制备了经液氮快速冷冻处理的乳腺癌细胞-LNT细胞,和基于LNT细胞负载化疗药物PTX的细胞载药递送系统（PTX@LNT）。经液氮快速冷冻的LNT细胞保留了完整的细胞结构,但失去了增殖能力和致病性,是理想的药物载体。此外,肿瘤细胞的内源性危险信号和TAAs等都完整保留在了LNT细胞中,使LNT细胞可以作为外源性疫苗,刺激DC成熟并激发机体的特异性抗肿瘤免疫应答。PTX是治疗TNBC最常用的化疗药物之一,不仅可以直接杀伤肿瘤细胞,还可以诱导肿瘤细胞发生ICD,通过释放TAAs和DAMPs,促进DC成熟并将抗原提呈给T淋巴细胞,增加了肿瘤的免疫原性。我们通过混合孵育的方式将PTX负载到LNT细胞中,获得的PTX@LNT载药系统具有以下优势:（1）具有高效的载药效能,载药率达到50%;（2）具有基于化疗的有效的ICD诱导作用,PTX@LNT与游离PTX具有相似的细胞毒性效应和ICD诱导能力,通过增加DAMPs的分泌,提高了肿瘤的免疫原性,进而诱导DCs成熟;（3）保留了肿瘤抗原和内源性危险信号,是诱导肿瘤抗原特异性免疫应答的免疫刺激递送系统;（4）制备过程简单,具有广泛的临床应用前景。第二部分验证了PTX@LNT细胞载药系统在小鼠TNBC模型中的抗肿瘤效果和免疫调节机制,并与PD-L1抑制剂联合治疗乳腺癌的肺转移。LNT细胞在动物模型中不具有增殖能力和致病效果,并可作为外源性疫苗有效预防肿瘤的生长。PTX@LNT载药系统在荷瘤小鼠模型中显示出最强的肿瘤抑制效果,PTX在杀伤肿瘤细胞的同时触发ICD效应,提高了肿瘤的免疫原性;此外,具有免疫激活效应的LNT细胞可诱导抗原特异性免疫细胞反应,与ICD效应协同增加了肿瘤组织中免疫细胞浸润水平,增强了抗肿瘤治疗效果。PTX@LNT显著促进了肿瘤组织中成熟DCs和CD8+细胞毒性T淋巴细胞的浸润,并通过减少调节性T细胞比例改善了TNBC免疫抑制的肿瘤微环境。然而,PTX的应用导致肿瘤组织PD-L1表达增强,因此我们在PTX@LNT治疗的基础上联合PD-L1抑制剂,通过阻断PD-1/PD-L1通路,重新激活耐受的T细胞功能并增加其对肿瘤的杀伤效果,有效地抑制了肿瘤的肺转移,并延长了小鼠的生存时间。综上所述,本文以LNT细胞载药递送系统为基础,通过负载化疗药物PTX成功构建了TNBC的治疗体系,在原发肿瘤和肺转移的治疗中展现出了巨大潜力。PTX@LNT具有LNT细胞的免疫刺激作用和PTX的ICD诱导能力,在杀伤肿瘤细胞的同时可以协同激活肿瘤特异性免疫反应,与免疫检查点抑制剂的联合治疗策略进一步增强了治疗效果,具有广泛的临床应用前景。