草莓SWEET17-like基因的鉴定及调控糖代谢功能初步分析

来源 :沈阳农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:THE_BOSS
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SWEET蛋白(Sugars will eventually be exported transporters,SWEETs)是新发现的糖转运蛋白。其功能主要是参与糖的运输,在植物生长发育和逆境胁迫中起作用,目前关于草莓SWEET基因家族功能的研究还处于空白阶段。本课题组前期研究发现增施适量的硫酸钾可提高草莓果实糖含量,为了进一步明确哪些基因在这一过程中发挥作用,利用转录组测序技术筛选出差异表达的SWEET17-like基因,从森林草莓‘Ruegen’和‘艳丽’中克隆获得SWEET17-like基因,并构建Fve SWEET17-like基因融合载体来分析其功能,主要结果如下:(1)以硫酸钾(0.0 g·L-1为CK,0.4 g·L-1为T1)处理的红果期草莓中可溶性固形物差异显著的果实为试材,混合送样进行转录组测序分析。筛选出742个差异基因,通过基因功能注释分析筛选出差异倍数相对较高的而且可能与糖代谢相关的SWEET17-like基因作为研究对象。(2)以‘Ruegen’和‘艳丽’草莓为试材,克隆差异表达基因SWEET17-like全长序列,测序结果表明SWEET17-like编码区长度为708 bp,编码235个氨基酸。将其与NCBI网站下载的二倍体草莓SWEET17序列进行比对,发现它们之间的氨基酸序列一致性为100%,并且该基因在不同草莓资源中高度保守。(3)q RT-PCR分析发现SWEET17-like在‘Ruegen’和‘艳丽’草莓的根、茎、叶、花、红果中均有表达,在花、叶中表达量最高,在红果中表达量低。并且,随着果实的成熟,SWEET17-like的表达量逐渐降低。通过GUS组织染色,也发现pro Fve SWEET17-like::GUS在绿果期的时候表达最强烈,随着果实成熟表达量下降,说明Fve SWEET17-like基因可能对草莓果实发育和糖积累产生影响。亚细胞定位试验显示Fve SWEET17-like蛋白定位在液泡膜上。(4)以p RI101-AN为载体,构建了Fve SWEET17-like过表达载体和沉默载体,分别命名为Fve SWEET17-like-AN和p RNAi-Fve SWEET17-like。利用构建好的载体,采用农杆菌介导的瞬时转化方法,以‘月华’和‘艳丽’草莓果实为试材,获得了Fve SWEET17-like的沉默和过表达瞬时转化草莓果实。与对照相比,发现过表达果实中蔗糖含量明显降低,而沉默果实中蔗糖含量显著增加,葡萄糖、果糖也有一定的变化。通过q RT-PCR试验发现与蔗糖合成相关的基因Fa SPSA3,Fa SUT2在沉默果实中表达量上升,与蔗糖水解相关的基因Fa CWINV1,Fa VIN1,Fa SUS1表达量均为下调。在过表达果实中与蔗糖水解相关的基因Fa VIN1,Fa SUS1,Fa CWINV1表达量上升,与蔗糖合成相关及与果糖、葡萄糖相关的基因Fa FRK2-like,Fa HK2,Fa SPSA3,Fa SUT2表达量下调。总体而言,与蔗糖合成和代谢相关酶基因表达量变化显著,而果糖激酶和已糖激酶基因表达量变化不明显,说明瞬时转化果实中蔗糖含量显著变化可能是Fve SWEET17-like过表达或沉默后,影响了蔗糖合成和降解相关酶基因的差异表达。(5)通过构建酵母功能载体p DR-Fve SWEET17-like,p DR-At SWEET1,p DR-At SUC2转化到酵母突变体菌株EBY.VW4000和SUSY7/ura3中,发现Fve SWEET17-like蛋白具有转运葡萄糖和蔗糖的能力。
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