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肝纤维化是因致病因子长期刺激导致肝脏受损,以细胞外基质（extracellular matrix,ECM）过度沉积、结缔组织异常增生为主要特点的肝脏结构和功能异常的病理过程。肝星状细胞（hepatic stellate cell,HSC）是ECM的主要来源。NADPH氧化酶（NADPH oxidase,NOX）家族的主要功能是催化产生活性氧（reactive oxygen species,ROS）,导致氧化应激的发生,HSC中主要表达NOX1、NOX2、NOX4。肝脏是过量ROS主要攻击的器官,导致氧化破坏,释放大量炎症因子,同时直接刺激HSC活化,导致纤维化。β-arrestin2是arrestin家族成员之一,是G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors,GPCRs）的调节蛋白,参与受体的脱敏和内化。研究发现,它还可以调节许多信号转导通路,影响ECM的沉积、炎症反应、氧化应激等,参与纤维化疾病进程。课题组前期研究结果表明,β-arrestin2在肝纤维化患者肝脏中的表达明显高于肝内胆管结石患者;体外使用β-arrestin2 siRNA转染HSC,可抑制其增殖和胶原产生。白芍总苷（total glucosides of paeony,TGP）是从芍药干燥根中提取的有效部位,其主要活性成分为芍药苷（paeoniflorin,Pae）,芍药苷-6’-O-苯磺酸酯（paeoniflorin-6’-O-benzene sulfonate,CP-25）是对Pae进行酯化修饰合成的新的单体衍生物,能有效提高Pae的生物利用度。TGP和Pae均具有良好抗氧化、炎症免疫调节活性。课题组前期研究表明,在CCl4诱导的肝纤维化小鼠模型中,CP-25具有良好的抗氧化作用,100 mg/kg的CP-25与同剂量的TGP相比,抗氧化活性更强。课题组以往研究表明β-arrestin2敲除可以减轻肝纤维化,CP-25具有抗氧化减轻肝纤维化的作用。那么β-arrestin2是否对NOX4具有调控作用呢?CP-25的抗纤维化作用又是否与调节氧化应激有关呢?为此,本研究使用β-arrestin2-/-小鼠建立CCl4诱导的肝纤维化模型,在整体水平观察β-arrestin2基因敲除对NOX4表达及氧化应激水平的影响;同时,对CCl4诱导的野生型（wide type,WT）肝纤维化小鼠灌胃给予CP-25,观察CP-25对NOX4的表达及氧化应激的调节作用;体外研究选用人肝星状细胞株LX-2,以血管紧张素（angiotensin Ⅱ,AngⅡ）刺激,建立体外ROS产生模型。分别转染针对β-arrestin2和NOX4的小干扰RNA,检测ROS水平和NOX4表达以及相关信号通路的变化,并给予CP-25,探讨其可能的作用机制。目的:使用WT C57BL/6J小鼠和β-arrestin2-/-小鼠诱导肝纤维化模型,造模不同时间点观察NOX4表达和肝纤维化形成情况;对CCl4诱导的WT肝纤维化小鼠灌胃给予CP-25,观察CP-25是否能调节氧化应激水平及NOX4表达影响肝纤维化;体外使用β-arrestin2和NOX4小干扰RNA转染LX-2细胞,同时给予CP-25,部分阐明其抗氧化作用机制。方法:使用10%CCl4油溶液（5 mL/kg）腹腔注射诱导WT C57BL/6J小鼠和β-arrestin2-/-小鼠建立肝纤维化模型,DHE活性氧荧光探针检测肝脏ROS表达水平,Western blot法检测肝组织中NOX4、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、MMP-13、TIMP-1的表达变化;10%CCl4油溶液（5 mL/kg）腹腔注射C57BL/6J小鼠6周（每周注射2次）,诱导肝纤维化模型,分为正常对照组、模型组、CP-25（25、50、100 mg/kg）组、TGP组（100 mg/kg）,检测氧化应激相关指标的变化;体外使用β-arrestin2和NOX4小干扰RNA转染LX-2细胞,同时给予CP-25,观察LX-2细胞ROS、NOX4、Ⅰ型胶原的表达变化,以及ERK、JNK信号通路的激活情况。结果:1.β-arrestin2基因敲除对CCl4诱导的肝纤维化小鼠的影响HE和Masson染色结果显示,β-arrestin2-/-模型小鼠肝脏中胶原沉积较少,脂肪变性和气球形变明显减少,纤维化程度较低。Western blot结果显示,相比于野生模型小鼠,β-arrestin2-/-纤维化小鼠肝脏中NOX4和Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的表达降低,MMP-13/TIMP-1比率升高。2.β-arrestin2基因敲除对小鼠肝脏冰冻切片中ROS表达的影响取小鼠肝脏OCT包埋液氮脱水速冻,制作肝脏冰冻切片,DHE荧光探针ROS染色结果显示,肝纤维化小鼠肝脏中ROS明显增强,β-arrestin2-/-纤维化小鼠ROS增加不明显。3.CP-25对CCl4诱导的小鼠纤维化的影响与肝纤维化模型组相比,灌胃给予CP-25（25、50、100 mg/kg）4周后,Western blot和免疫组化结果显示,CP-25可降低肝组织NOX4、Ⅲ型胶原和β-arrestin2的表达,同时可以升高MMP-13/TIMP-1比率。4.LX-2细胞分别转染针对β-arrestin2 siRNA和NOX4 siRNA对ROS、NOX4、Ⅰ型胶原表达以及ERK、JNK信号通路激活的影响DCFH-DA活性氧荧光探针和流式细胞术结果显示,10-66 mol/L AngII刺激可使LX-2细胞ROS的产生增加,NOX4 siRNA可降低LX-2细胞ROS的生成。Western blot结果显示,向LX-2细胞中转染NOX4 siRNA可抑制NOX4和Ⅰ型胶原的生成。向LX-2细胞中转染β-arrestin2 siRNA可抑制LX-2细胞中NOX4的表达,减少ROS和Ⅰ型胶原的生成,并明显抑制ERK和JNK的磷酸化水平。5.CP-25对LX-2细胞中ROS、Ⅰ型胶原、NOX4、β-arrestin2表达的影响DCFH-DA活性氧荧光探针和流式细胞术结果显示,体外给予CP-25(10-8、10-7、10-6、10-5 mol/L)可抑制LX-2细胞中ROS的生成。Western blot结果显示,CP-25(10-7、10-6、10-5 mol/L)可降低LX-2细胞中Ⅰ型胶原、NOX4、β-arrestin2的表达。结论:1.β-arrestin2-/-小鼠相比于WT小鼠肝纤维化程度明显减轻,NOX4、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的表达降低,MMP-13/TIMP-1比率升高。提示β-arrestin2基因敲除可能通过抑制NOX4、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的表达,升高MMP-13/TIMP-1比率,减轻小鼠肝纤维化。2.β-arrestin2-/-小鼠相比于WT肝纤维化小鼠,肝脏ROS表达明显降低,提示β-arrestin2可能与氧化应激引起的肝纤维化发生发展有关。3.体外向LX-2细胞转染NOX4 siRNA可降低ROS和Ⅰ型胶原的生成;转染β-arrestin2 siRNA可抑制ROS、NOX4、Ⅰ型胶原的生成,以及ERK和JNK的磷酸化。提示NOX4可介导LX-2细胞ROS的产生,低表达β-arrestin2可能通过下调NOX4,抑制ERK、JNK通路的激活,发挥抑制ROS和胶原生成的作用。4.CP-25可降低肝纤维化小鼠NOX4、Ⅲ型胶原和β-arrestin2的表达,升高MMP-13/TIMP-1比率;体外给予CP-25,可降低LX-2细胞中ROS的生成,抑制Ⅰ型胶原、NOX4、β-arrestin2的表达。提示CP-25可能通过下调β-arrestin2,抑制NOX4的表达,从而抑制ROS的生成,减弱氧化应激反应,发挥抗肝纤维化作用。