论文部分内容阅读
第一章Notch1在肝细胞癌中的表达及其与HBV感染的关系目的：Notch1广泛表达于多种组织中,与肿瘤的发生发展相关。本研究旨在了解Notch1基因在肝癌发生发展中的作用；分析肝癌致癌机制中乙肝病毒与Notch1相互作用关系；初步探讨Notch1基因在早期诊断中的价值以及作为肿瘤治疗靶点的可行性。方法：采用Western-blotting在蛋白水平分别检测80例肝癌和80例正常肝组织中Notch1的表达,其中10例用RT-PCR检测1mRNA的表达；采用免疫组化分析Notch1蛋白在石蜡包埋肝癌组织切片中的定位;用PCR检测所有标本HBV感染率,并分析HBX与Notch1在肝癌发病中的相互关系。结果：Westren blot结果表明,80例肝癌标本中Notch1蛋白表达阳性率为10.0%(8/80),而80例正常肝组织Notch1阳性表达率为92.5%(74/80)；RT-PCR检测结果表明肝癌中Notch1的下调是在mRNA水平；免疫组化结果显示Notch1蛋白在正常肝组织中高表达,定位于细胞浆及胞核内,而肝癌组织则不表达；PCR检测肝癌组织中HBX感染率为81.25%(65/80),而正常组织中HBV X Protein DNA阳性表达率仅为0.25%(2/80)；HBX阴性的肝癌组织中Notch1蛋白表达阳性率高于HBX阴性者(分别46.67%与1.54%),两者差异头统计学意义(P=0.001),并进一步在RNA水平验证了HBV与Notch1呈负相关关系。Notch1蛋白表达与临床病理因素的关系分析结果表明：Notch1与临床分期相关,两者有统计学差异(P=0.001)；而与年龄、肿瘤大、组织分化、淋巴结是否转移及避期疗效无关。结论：Notchl在肝癌发生发展中发挥抑癌作用,Notchl可阻止HBX诱导的细胞的恶性转化,Notchl下调是HBX诱导的肝癌晚期阶段的重要步骤。Notchl可能有助于肝癌的分期,作为肝癌肿瘤标记物可能性和治疗靶点的可行性尚待进一步研究。第二章Notch1基因对人肝癌HpeG2细胞增殖和周期的影响及其机制的初步研究目的：1、检测Notch1基因对人肝癌HepG2细胞增殖和细胞周期的影响。2、探讨Notch1基因影响人肝癌HepG2细胞增殖和周期的可能机制。方法：1、利用Notch1-shRNA和真核表达质粒pNotch1-IRES2-EGFP转染人肝癌HepG2细胞,RT-PCR和Western Blotting法筛选和鉴定Notch1表达下调或上调的HepG2细胞。2、MTT法和PI单染流式细胞术分析Notch1对细胞增殖和细胞周期的影响。3、采用RT-PCR和Western blotting法检测NF-κβ表达；EMSA法检测NF-κβ的活性。结果：1、Notchl-shRNA真核表达载体能有效下调HepG2细胞Notchl的表达,而pNotch1-IRES2-EGFP真核表达载体能有效上调HepG2细胞Notch1的表达。2、Notch1基因表达上调的细胞其细胞增殖能力受到明显抑制(P<0.01),并引起细胞G1期阻滞(P<0.01),S期细胞减少(P<0.01)；在Notch1表达下调的细胞其增殖能力明显增强(P<0.01),且引起G1期细胞减少(P<0.05),S期细胞增加(P<0.01)。3、Notch1基因表达上调的细胞其NF-κβmRNA和蛋白表达水平显著降低(P<0.05),NF-κβDNA结合活性显著降低(P<0.01)；在Notchl表达下调的细胞其NF-κβmRNA和蛋白表达水平显著增加(P<0.01),NF-κβDNA结合活性显著增加(P<0.01)。结论：1、Notchl基因与人肝癌HepG2细胞的增殖能力和周期调控密切相关。2、Notchl基因可能通过NF-κβ通路影响HepG2细胞的增殖。第三章藏红花对人肝癌HepG2细胞的作用机制目的：观察藏红花提取物对肝癌HepG2细胞增殖的抑制作用并探其机制。方法：MTT法观察藏红花提取物对肝癌HepG2细胞增殖的影响；流式细胞仪检测藏红花提取物对HepG2细胞周期的影响；western blot检测藏红花提取物作用前后HepG2细胞中notch1、c-myc、p21、cdk2及cyclinE蛋白表达的变化。结果：藏对肝癌HepG2细胞的生长增殖有明显抑制作用,呈浓度和时间依赖性。流式细胞仪检测显示给药后细胞被阻滞在G0/G1期,western blot分析显示,藏红花提取物作用后HepG2细胞p21和Notch1蛋白表达水平上调,cyclinE、cdk2、c-myc蛋白表达水平下调。结论：藏红花提取物可显著抑制肝癌HepG2细胞的增殖,诱导HepG2细胞发生G0/G1期阻滞、凋亡和坏死,周期阻滞作用可能与激活Notch1信号通路有关。