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目的:随着现代儿科麻醉技术的提高,患儿父母之前关心的生死的问题,逐渐转变为更高级的需求:是否能降低全麻药对幼儿的学习记忆能力的影响。现今儿科麻醉常用全麻药物为七氟醚。近些年来,越来越多的体外实验,动物实验已经证实七氟醚可造成发育期大脑海马突触功能障碍,持久的记忆认知功能损害。但其神经毒性及影响神经发育的机制仍然不清,这使“全麻药对脑发育的影响”及如何规避全麻药物神经毒性,成为麻醉,神经科学等领域研究的热点。故我们以此为基准,来研究七氟醚致发育期神经发育异常的机制,并以此为靶点研究如何减少七氟醚神经毒性的发生。影响突触可塑性是全麻药致发育期大脑认知能力下降的重要原因。组织型纤溶酶原激活剂（Tissue plasminogen activatort,t PA）在中枢神经系统中能够通过激活无活性的纤溶酶原转换成有活性的纤溶酶,纤溶酶可裂解脑源性神经营养因子前体（Precursor form of Brain-derived neurotrophic factor,pro BDNF）,pro BDNF经过蛋白酶裂解为成熟的脑源性神经营养因子（Brain-derived neurotrophic factor,BDNF）从而对突触可塑性有着很重要的调控作用。Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制因子（type 1 inhibitor of plasminogen activator,PAI-1）是脑内t PA的生理抑制剂。现今越来越多的学者认为t PA/PAI-1裂解系统在神经可塑性和认知记忆过程中发挥着重要的调节作用,能够影响海马长时程可塑性。因此我们推测发育期大鼠反复吸入七氟醚可能影响海马内的纤溶酶系统t PA/PAI-1之间的平衡,从而影响BDNF的前体向成熟体的裂解。于是本课题首先观察多次吸入七氟醚对发育期大鼠远期学习记忆能力及突触可塑性的影响,探讨t PA/PAI-1纤溶系统改变的作用机制及与脑源性神经营养因子/酪氨酸激酶受体B（Brain-derived neurotrophic factor/Tyrosine kinase receptor B,BNDF/Trk B）信号通路的调控关系。研究方法:1、6日龄新生SD雄性大鼠72只,体重10-12g,随机分组分为2组,每组36只。对照组（Con group）连续三天,每天2小时,吸入40%氧气和60%氮气。七氟醚组（Sevoflurane group）连续三天,每天2小时,吸入3%七氟醚与40%氧气和60%氮气混合气体。之后归还至鼠笼,由母鼠喂养。在造模结束后24h,48h及72h三个时间点,各组随机选取6只大鼠,用戊巴比妥钠（100 mg/kg）麻醉,断头取脑,冰上剥离海马,应用Western-blot法检测海马组织中PAI-1、t PA、pro BDNF、m BDNF、Trk B、p-Trk B蛋白表达情况。应用Elisa法测24h,48h,72h的t PA水平。在造模结束后24h,各组随机选取6只大鼠,4%多聚甲醛心脏灌注断头取脑,免疫荧光法检测PAI-1、t PA、pro BDNF、m BDNF脑内蛋白表达情况。剩下的大鼠继续由其母鼠喂养,至第21天与母鼠分笼。在第28天时两组剩余大鼠进行Morris水迷宫行为学实验。水迷宫实验（6天）后即大鼠33天龄时随机选取6只鼠麻醉后断头取脑,冰上剥离海马,应用Western-blot法（免疫印迹法）检测海马组织中蛋白突触素（synaptophysin,SYN）、突触后致密物-95（postsynaptic density 95,PSD-95）、神经生长蛋白-43（growth associated protein 43,GAP-43）。随机选取6只,行高尔基Golgi-cox染色树突棘密度测定。2、新生5天（P5）SD雄性大鼠120只,体重10-12g,随机分组分为4组,分别为对照组（Con组）,七氟醚组（Sev组）,七氟醚+重组t-PA（t PA组）,七氟醚+PAI-1抑制剂TM5275组（TM5275组）,每组30只。P5:TM5275组新生鼠灌胃给药PAI-1抑制剂TM5275（50 mg/kg）,Con组,Sev组,t PA组给予体重对应的相同体积盐水灌胃。P6:灌胃后一天,t PA组经鼻给予重组t-PA,将t-PA溶解于PBS（2μg/μL）,并以2mg/kg的剂量鼻内给药,每个鼻孔3次（每次鼻孔约5μL）,给药间隔为5分钟。Con组,Sev组,TM5275组使用体重对应的相同体积的无菌PBS对照,30 min后Sev组,t PA组,TM5275组吸入3%七氟醚与40%氧气和60%氮气混合气体。Con组吸入40%氧气和60%氮气混合气体。所有操作在第七天,第八天处置同第六天。实验结束后和母鼠置于同一鼠笼内,正常喂养。在造模结束后24h,48h及72h三个时间点,各组随机选取6只大鼠,应用Western-blot法检测海马组织中PAI-1,t PA,pro BDNF,m BDNF,Trk B,p-Trk B蛋白表达情况。剩下的大鼠继续由其母鼠饲养,至第21天与母鼠分笼。在第28天时四组组剩余大鼠每组12只进行Morris水迷宫行为学实验。水迷宫实验后大鼠33天龄时随机选取6只鼠麻醉后断头取脑,冰上剥离海马,应用Western-blot法检测海马组织中SYN,PSD-95,GAP-43突触相关蛋白。随机选取6只行Golgi-cox染色行树突棘密度测定。3、选取出生5天的SD大鼠72只,随机分成六组:对照组（Con组）、七氟醚组（Sev组）、七氟醚+t-PA（t PA组）、七氟醚+PAI-1抑制剂TM5275组（TM5275组）、七氟醚+t-PA+Trk B抑制剂（ANA-12组）及七氟醚+TM5275+Trk B抑制剂（TMANA-12B组）,每组12只。Con组、Sev组、t PA组、TM5275组的实验方法同上。抑制剂组（ANA-12组）及（TMANA-12B组）腹腔内注射ANA-12（0.5mg/kg）,ANA-12组和TMANA-12B组大鼠需要在给予干预药物t PA或TM5275后30min时,腹腔注射ANA-12（0.5mg/kg）,每组大鼠每天在给予所有药后1小时进行七氟醚吸入或对应的对照组气体吸入。第28天进行水迷宫测试,33天进行突触蛋白检测及Golgi-Cox染色,实验操作同上。结果:1、P6,P7,P8三天,每日吸入七氟醚2小时,能够导致28天大鼠学习记忆功能障碍和33天突触可塑性下降:Sev组的逃避潜伏期增加,穿越平台次数减少。Sev组的SYN,PSD-95,GAP-43突触相关蛋白表达降低,Golgi-cox染色中树突棘密度降低。在造模后24h,48h,72h海马组织中pro BDNF及PAI-1蛋白表达增加,m BDNF,t PA及p-Trk B蛋白表达降低。2、t PA或TM5275能够逆转七氟醚暴露引起的大鼠学习记忆功能障碍,干预后学习记忆能力提高,突触密度增加,抑制pro BDNF及PAI-1蛋白表达,升高m BDNF,t PA及p-Trk B蛋白表达。3、使用Trk B通路抑制剂ANA-12后,给予t PA及TM5275使其对大鼠七氟醚神经损伤的保护下降,学习记忆能力下降,突触蛋白表达降低,树突棘密度下降。t PA及TM5275对多次吸醚后大鼠的神经保护作用被ANA-12阻断。结论:1、新生六日SD大鼠每天2小时,连续3天,吸入全身麻醉药物七氟醚,降低了28天大鼠的学习记忆能力及突触可塑性。2、七氟醚通过介导大鼠中枢神经系统t PA/PAI-1系统失衡,抑制pro BDNF向成熟BDNF裂解和下游Trk B信号通路的激活,降低海马突触可塑性,导致大鼠远期学习记忆能力障碍。3、外源性重组t-PA及PAI-1的抑制剂TM5275均可以缓解七氟醚引起的t PA/PAI-1纤溶系统异常,改善BDNF从前体到成熟体裂解障碍,从而缓解七氟醚引起的学习记忆能力下降及突触可塑性的降低。4、t PA,TM5275通过激活BNDF/Trk B通路起到神经突触保护作用。