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D-缬氨酸，化学名为D-2-氨基-3-甲基丁酸，是合成抗生素、生理活性肽、农药等多种产品的重要原料，广泛应用于医学、生物和农业等研究领域，D-缬氨酸应用带动了其制备技术研究的发展。D-型氨基酸的制备方法主要有两类：一是利用酶或化学不对称合成，二是通过化学法外消旋后进行手性拆分。 N-酰基-D-氨基酸酰胺水解酶(D-氨基酰化酶，3.5.1.81)催化的手性拆分是目前制备D-型氨基酸的主要途径。不同来源的D-ANase对不同底物的催化效率差别较大，其最适作用底物一般为D-Met、D-Leu及D-Phe的N-酰基衍生物，但是对于手性合成领域中作为重要有机手性源的D-缬氨酸的N-酰基衍生物，部分D-ANase转化效率较低。以D-缬氨酸作为衡量指标，Alcaligenes属来源的D-氨基酰化酶活力最高。将来源于Alcaligenes A-6的D-氨基酰化酶基因用大肠杆菌中的丰沛密码子替换，利用化学和基于PCR技术的酶促方法进行基因全合成，利用pET-32a构建重组表达载体pET-trx-dan，转化进E.coli BL21(DE3)中进行融合表达。经SDS-PAGE、Western-blot和活性测定，D-ANase可在大肠杆菌中进行高效表达，目的蛋白能够达到菌体总蛋白的64%，密码子优化菌株的发酵酶活为96U/mL；去掉融合标签，直接利用T7启动子表达的D-ANase，D-ANase表达量占菌体总蛋白的53%，密码子优化菌株的发酵酶活为52U/mL，密码子未优化菌株的发酵酶活为39U/mL。利用CLC Main Workbench6预测非融合表达载体pET-dan转录mRNA的TIR区二级结构，统计起始密码子ATG下游连续四个氨基酸同义密码子替换后144种序列的ΔG值、ATG区域以及RBS区域形成的双键数量。挑选出ΔG值高、中、低三组序列，每组各6个，构建非融合表达载体并检测外源蛋白的表达和D-ANase活性。ΔG绝对值低组可明显的外源蛋白表达，也能检测到较高的菌体内酶活。进一步的酶学性质研究表明，Alcaligenes A-6的D-ANase对D-氨基酸的酰基衍生物具有较好的立体选择性，对D-丙氨酸、D-亮氨酸、D-甲硫氨酸、D-苯丙氨酸、D-色氨酸、D-缬氨酸的底物有活性。以N-乙酰-DL-缬氨酸为底物，底物浓度10mmol/L，55℃、pH7.0～pH8.0时酶的催化效率最高；D-ANase固定化可更加高效的利用工程菌发酵得到的酶活力，经过十批次连续拆分N-乙酰-DL-缬氨酸，酶活还保留有原酶活的78%，为工业化应用奠定良好基础。