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液泡加工酶VPE在植物防御反应中发挥着重要作用,影响植物的抗性,是植物抗病防御机制研究的关键蛋白之一.细菌和真菌病原均能诱导VPE的表达及激活,激活的VPE通过加工液泡内其他功能蛋白使之成熟促进液泡破裂,进而参与多种不同条件下的程序性细胞死亡过程,这意味着在正常条件下VPE的活性受到严格的调控,但这种调控表达机制还不清楚.另外,病原侵染诱导VPE的积累,但VPE的高水平积累和激活对宿主防御反应的影响尚不清楚.本研究通过对轮纹病菌侵染及模拟侵染的差异表达基因进行分析,发现了一个高度响应Botryosphaeriadothidea侵染的液泡加工酶基因,命名为MdVPE1.对该基因进行克隆和鉴定,并对其表达和激活进行分析,同时通过异源表达分析其对宿主植物免疫反应的影响.研究结果如下:
1.苹果液泡加工酶MdVPE1基因的克隆和鉴定
以‘富士’枝皮cDNA为模板,克隆得到目的基因,命名为MdVPE1.MdVPE1基因编码区为1389bp,预测该蛋白的分子量为51.2kD,编码463个氨基酸,等电点(pI)为6.35.MdVPE1蛋白包含一段信号肽和一段Peptidase-C13结构域,该结构域属于VPE家族蛋白,而该蛋白是一种有Caspase-1样活性酶,参与介导了植物编程性细胞死亡(PCD).构建PUC-35S-sGFP-MdVPE1载体,转化原生质体进行亚细胞定位,显示MdVPE1基因定位于液泡.
2.苹果轮纹病菌诱导VPE基因的表达
对轮纹病菌侵染后的‘富士’苹果枝皮组织的基因表达进行分析,发现MdVPE1、MdVPE2、MdVPE3、MdVPE6、MdVPE8表现为显著的表达升高,而MdVPE5和MdVPE7没有显著的变化.系统发育分析显示,MdVPE1与AtVPEδ聚在一个亚群,已有研究表明AtVPEδ参与植物对病原的免疫防御,推测MdVPE1蛋白可能也参与苹果植物对轮纹病菌侵染的防御反应.
3.轮纹病菌侵染促进MdVPE1蛋白的激活
通过大肠杆菌表达系统表达MdVPE1蛋白,纯化后测定其活性.重组的MdVPE1蛋白能有效切割VPE荧光底物Ac-ESEN-MCA和Caspase-1底物Ac-YVAD-MCA,而且二者均可被Caspase-1抑制剂Ac-YVAD-CHO所抑制,表明MdVPE1具有Caspase-1类似的活性.用MdVPE1特异抗体通过Westernblot对轮纹病菌模拟侵染及侵染后MdVPE1蛋白的变化进行分析,发现轮纹病菌侵染促进了MdVPE1蛋白由前体向成熟蛋白的转化.提取枝皮总蛋白测定VPE酶活性,显示轮纹病菌侵染后VPE酶活显著上升,这一结果证实在轮纹病菌侵染后VPE酶活的显著变化是因为VPE响应轮纹病菌侵染增加导致,并通过chitin和flg22诱导激活MdVPE1蛋白实验,进一步证明VPE蛋白的激活是受转录后水平调控.
4.MdVPE1异源过表达降低了植物对Alternariabrassicicola和Pseudomonassyringae的抗病性
将MdVPE1重组载体与空载体对照分别转化拟南芥进行异源过表达.经PCR、Semi-PCR、qRT-PCR和Westernblot检测,获得阳性拟南芥植株.通过对拟南芥T3代纯合阳性植株分别接种真菌病原A.brassicicola和细菌病原P.syringae来检验转基因拟南芥的抗病性.结果显示,MdVPE1过表达显著降低了拟南芥对真菌病原A.brassicicola和细菌病原P.syringae的抗病性.
5.MdVPE1基因影响防御基因的表达
为确定植物防御相关基因是否受到MdVPE1表达的影响,检测了PR1、PDF1.2和PAD3基因的表达.结果显示,A.brassicicola侵染诱导PR1和PDF1.2基因在WT、EV和OE植株表达上调,WT、EV和OE之间没有显著差异;PAD3基因在WT、EV和OE植株中显著上调,在OE植株中显著低于WT和EV植株.P.syringae侵染后,WT、EV和OE植株中PR1和PDF1.2基因的表达都显著上调,其中WT、EV和三个OE植株PR1基因表达量无显著差异,但WT和EV植株中PDF1.2基因相对表达量显著高于三个OE植株;PAD3基因的表达在P.syringae侵染后上调幅度较小,但也表现为统计学上的显著性.
6.MdVPE1基因的过表达影响活性氧的积累及胼胝质的沉积
Chitin和flg22处理显著提高WT、EV和OE植株胼胝质的沉积,但是MdVPE1过表达植株胼胝质沉积要小于WT和EV植株.chitin和flg22处理导致H2O2积累发生显著变化.野生型和空载体植株H2O2积累显著高于MdVPE1过表达转基因植株.
上述结果表明,MdVPE1基因能够响应轮纹病菌侵染而在细胞内积累,其蛋白水平上的激活成熟也受病原诱导.MdVPE1基因过表达降低了宿主植物对真菌病原A.brassicicola和细菌病原P.syringae的抗性,抗性的降低与胼胝质沉积减少、过氧化氢的积累及防御基因的表达有关.
1.苹果液泡加工酶MdVPE1基因的克隆和鉴定
以‘富士’枝皮cDNA为模板,克隆得到目的基因,命名为MdVPE1.MdVPE1基因编码区为1389bp,预测该蛋白的分子量为51.2kD,编码463个氨基酸,等电点(pI)为6.35.MdVPE1蛋白包含一段信号肽和一段Peptidase-C13结构域,该结构域属于VPE家族蛋白,而该蛋白是一种有Caspase-1样活性酶,参与介导了植物编程性细胞死亡(PCD).构建PUC-35S-sGFP-MdVPE1载体,转化原生质体进行亚细胞定位,显示MdVPE1基因定位于液泡.
2.苹果轮纹病菌诱导VPE基因的表达
对轮纹病菌侵染后的‘富士’苹果枝皮组织的基因表达进行分析,发现MdVPE1、MdVPE2、MdVPE3、MdVPE6、MdVPE8表现为显著的表达升高,而MdVPE5和MdVPE7没有显著的变化.系统发育分析显示,MdVPE1与AtVPEδ聚在一个亚群,已有研究表明AtVPEδ参与植物对病原的免疫防御,推测MdVPE1蛋白可能也参与苹果植物对轮纹病菌侵染的防御反应.
3.轮纹病菌侵染促进MdVPE1蛋白的激活
通过大肠杆菌表达系统表达MdVPE1蛋白,纯化后测定其活性.重组的MdVPE1蛋白能有效切割VPE荧光底物Ac-ESEN-MCA和Caspase-1底物Ac-YVAD-MCA,而且二者均可被Caspase-1抑制剂Ac-YVAD-CHO所抑制,表明MdVPE1具有Caspase-1类似的活性.用MdVPE1特异抗体通过Westernblot对轮纹病菌模拟侵染及侵染后MdVPE1蛋白的变化进行分析,发现轮纹病菌侵染促进了MdVPE1蛋白由前体向成熟蛋白的转化.提取枝皮总蛋白测定VPE酶活性,显示轮纹病菌侵染后VPE酶活显著上升,这一结果证实在轮纹病菌侵染后VPE酶活的显著变化是因为VPE响应轮纹病菌侵染增加导致,并通过chitin和flg22诱导激活MdVPE1蛋白实验,进一步证明VPE蛋白的激活是受转录后水平调控.
4.MdVPE1异源过表达降低了植物对Alternariabrassicicola和Pseudomonassyringae的抗病性
将MdVPE1重组载体与空载体对照分别转化拟南芥进行异源过表达.经PCR、Semi-PCR、qRT-PCR和Westernblot检测,获得阳性拟南芥植株.通过对拟南芥T3代纯合阳性植株分别接种真菌病原A.brassicicola和细菌病原P.syringae来检验转基因拟南芥的抗病性.结果显示,MdVPE1过表达显著降低了拟南芥对真菌病原A.brassicicola和细菌病原P.syringae的抗病性.
5.MdVPE1基因影响防御基因的表达
为确定植物防御相关基因是否受到MdVPE1表达的影响,检测了PR1、PDF1.2和PAD3基因的表达.结果显示,A.brassicicola侵染诱导PR1和PDF1.2基因在WT、EV和OE植株表达上调,WT、EV和OE之间没有显著差异;PAD3基因在WT、EV和OE植株中显著上调,在OE植株中显著低于WT和EV植株.P.syringae侵染后,WT、EV和OE植株中PR1和PDF1.2基因的表达都显著上调,其中WT、EV和三个OE植株PR1基因表达量无显著差异,但WT和EV植株中PDF1.2基因相对表达量显著高于三个OE植株;PAD3基因的表达在P.syringae侵染后上调幅度较小,但也表现为统计学上的显著性.
6.MdVPE1基因的过表达影响活性氧的积累及胼胝质的沉积
Chitin和flg22处理显著提高WT、EV和OE植株胼胝质的沉积,但是MdVPE1过表达植株胼胝质沉积要小于WT和EV植株.chitin和flg22处理导致H2O2积累发生显著变化.野生型和空载体植株H2O2积累显著高于MdVPE1过表达转基因植株.
上述结果表明,MdVPE1基因能够响应轮纹病菌侵染而在细胞内积累,其蛋白水平上的激活成熟也受病原诱导.MdVPE1基因过表达降低了宿主植物对真菌病原A.brassicicola和细菌病原P.syringae的抗性,抗性的降低与胼胝质沉积减少、过氧化氢的积累及防御基因的表达有关.