随着医疗医疗技术的发展,人们逐渐对心肌缺血再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury, I/R injury)有了更多的认识。目前,对缺血再灌注损伤保护策略的研究主要集中在缺血预适应(ischemic preconditioning, IPre)的保护作用机制上,其对缺血再灌注损伤具有明显的保护作用。但是,由于心肌缺血的不可预知性,限制了缺血预适应在临床上的应用。有研究表明缺血后适应(ischemic postconditioning, IPostC)具有与缺血预适应类似的保护效应,由于缺血预适应是在缺血再灌注开始后实施,使其具有更好的临床可操作性。因此,对缺血后适应的研究将具有更高的临床价值。近年来研究发现,引起心肌缺血再灌注损伤的主要因素有氧化应激以及钙超载,而缺血后适应能够减轻缺血再灌注损伤心肌的氧化应激水平并改善钙超载状态,保护心肌,但是其具体机制尚不明确。一氧化氮作为活性小分子,发挥着重要的生理病理调节作用。由于一氧化氮合酶在细胞中的不同定位,其产生的NO也发挥着不同的作用。神经元型一氧化氮合酶(nNOS)主要定位于肌浆网和线粒体中,通过控制细胞内的钙和“硝基化-氧化还原反应”平衡来维持肌浆网和线粒体的生理功能。在某些病理条件下,nNOS可以通过调节细胞内钙浓度以及抑制黄嘌呤氧化还原酶(XOR)的活性,减轻细胞的氧化应激水平来达到保护细胞的目的。由此可见,nNOS与心肌细胞的氧化应激水平以及钙超载状态有密切关系,但是,缺血后适应是否能通过调节心肌细胞中nNOS的表达和活性来减轻缺血再灌注损伤新机的氧化应激水平和钙超载状态,尚未见文献报道。因此,我们通过小鼠离体心脏Langendoiff缺血再灌注模型和体外培养心肌缺氧复氧模型,对nNOS在缺血后适应减轻缺血再灌注心肌损伤中的作用机制进行研究。第一部分nNOS在缺血后适应减轻缺血再灌注心肌损伤中的作用目的：研究nNOS在缺血再灌注损伤以及缺血后适应中的作用方法：小鼠离体心脏缺血再灌注模型以及体外培养心肌细胞缺氧复氧模型建立；利用TTC染色和HE染色对离体心脏心肌梗死面积和心肌超微结构进行观察测定；对心肌组织LDH进行测定分析心肌损伤程度；利用Annexin V-FITC法对细胞凋亡进行测定。结果：缺血后适应能够显著恢复缺血再灌注损伤心脏的功能,减少梗死面积,改善心肌超微结构的损伤情况,降低心肌细胞的凋亡率。nNOS选择性抑制剂L-VNIO能够取消缺血后适应的心肌保护作用。而在缺血再灌注时单独给予L-VNIO也产生了与缺血后适应相类似的保护效应。第二部分nNOS参与缺血后适应减轻缺血再灌注心肌损伤的机制研究目的：研究nNOS在缺血再灌注损伤以及缺血后适应中的作用机制方法：利用western blot和同位素法对nNOS的磷酸化水平和活性进行测定；利用western blot方法对心肌组织硝基化酪氨酸的表达进行测定；通过测定细胞中MDA和ROS生成量评价心肌氧化应激水平；用vestern blot和RT-PCR方法对氧化应激相关通路的蛋白和基因水平进行检测,如AMPK, p-AMPK (Thr172), PGC-1a;通过Fluo-3/AM钙离子探针测定复氧早期心肌细胞Ca2+水平以及肌浆网钙储存能力。结果：缺血后适应明显降低了缺血再灌注损伤心肌细线粒体中nNOS的活性,减少了损伤心肌细胞中ONOO-水平；显著增加了心肌细胞胞浆中nNOS的活性,恢复胞浆中NO水平,一方面通过nNOS/AMPK/PGC-1α通路减轻细胞氧化应激水平,一方面促进受磷蛋白磷酸化,提高肌浆网钙摄取和储存能力,减轻细胞钙超载。nNOS选择性抑制剂L-VNIO取消了IPostC的心肌保护作用。再灌注时单独给予L-VNIO能抑制线粒体nNOS的活性,减少ONOO-的生成,减轻氧化应激水平,保护缺血再灌注损伤心肌。结论：nNOS参与了心肌缺血再灌注损伤过程,在缺血再灌注损伤发生时,心肌细胞胞浆中nNOS活性降低,线粒体中nNOS活性增加,引起再灌注损伤。nNOS在缺血后适应保护作用中也起到重要作用,缺血后适应通过增加心肌细胞胞浆中nNOS活性,降低线粒体中nNOS活性,减轻细胞氧化应激水平和钙超载状态,保护缺血再灌注损伤心脏。