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基因家族(Gene Family)是由同一个祖先基因通过基因重复事件产生的所有基因的总称,基因家族的起源、演化、以及功能分化一直是进化生物学所关注的核心问题。本文以17种已经完成基因组测序的真菌为研究对象,在基因组和蛋白质功能层次上研究了谷胱甘肽转移酶(Glutathione S-Transferase,GST)基因家族起源、进化及功能分化的模式,获得如下结果：
⑴从已经完成基因组测序的17种真菌基因组中共鉴定出148个GST基因成员,分为9个亚家族或类型:Ure2p、EF1Bγ、eLigE、GTT1、Sigma、Zeta、Phi、ClusterⅠ和ClusterⅡ。其中Ure2p和EFIBγ是最大的亚家族,分别含有39和36个GST基因成员；Zeta和ClusterⅡ是最小的亚家族,分别含有4和3个GST基因成员。Ure2p和EF1By亚家族GST基因在所有17种真菌中都有分布,而其他7个亚家族GST基因仅仅在部分真菌中有分布。
⑵GST基因在染色体上的定位分析发现,除了汉逊德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)染色体D上有2个GTT1亚族基因成员(DhaGSTW1,DhaGSTW2)呈串联重复排列外,17种真菌中其余所有GS7基因成员在染色体上均呈散在分布,说明散在重复是真菌基因家族的一个基本特征,可能对真菌GST基因家族扩张有重要作用。
⑶发现GST基因家族成员数在不同真菌物种中存在较大差异,如LJre2p亚族GST基因在曲霉属(Aspergillus)3种真菌基因组中分别有3-4个基因成员,而在酵母科(Saccharomycetaceae)的4种真菌基因组中均只有1个基因成员,基因成员数的差异可能与不同真菌生活史或适应性相关。另外,在整个真菌GST基因家族中,内含子的获得或者丢失是非常普遍的现象,可能预示着真菌GST基因家族可能存在明显的功能分化。
⑷水平基因转移(Horizontal Gene Transfer,HGT)在植物和真菌的进化历史中扮演重要角色,我们发现真菌Phi类GST基因可能是通过HGT事件从植物中产生。系统发育分析发现HGT事件可能发生于苔藓植物的祖先中,总共可能发生2次水平基因转移事件,一次发生在盘菌亚门(Pezizomycotina)祖先中,另一次可能发生在双色蜡蘑(Laccaria bicolor)或其祖先中。
⑸利用荧光定量PCR分析了烟曲霉(Aspergillus fumigatus)12个GST基因在正常生长及H2O2、CDNB、ECA和NBC等四种胁迫处理下的表达模式,发现不同GST基因在相同胁迫处理下有着明显不同的表达模式,如在NBC的胁迫处理下有4个基因表达上调3-1813倍,而有7个基因表达下调1-35倍,这说明烟曲霉GST基因家族成员间的表达模式存在显著差异。
⑹从烟曲霉中克隆了12个GST基因并构建了表达载体,并在大肠杆菌中成功表达纯化了11个重组GST酶蛋白,分析了GST蛋白的底物特异性和催化活性。我们发现不同GST蛋白的底物谱有很大区别,且对于同一底物的酶学活性也具有显著差异,这预示着它们的功能有了显著分化。
⑺真菌Ure2p亚家族GST基因催化中心氨基酸没有羟基或巯基,无法和GSH进行有效的结合而被认为不具有解毒功能。但本研究发现烟曲霉AfuGSTR2蛋白对CDNB与NBD-Cl有着很高的活性,分别是2.051和0.159μmol/min·per·mg。酶促动力学分析发现AfuGS7R2蛋白对GSH和CDNB的Km值分别是0.12mM和0.97mM,这说明AfuGSTR2蛋白对底物GSH和CDNB有着很强的亲和力,因此我们推测至少部分Ure2p亚家族GS工具有催化解毒的功能,但其催化解毒机理有待于进一步研究。
⑻综合真菌GST基因家族的系统发育关系、基因结构、基因表达模式、酶底物特异性等数据,本研究系统地阐述了真菌GST基因家族的进化和功能分化模式,为真菌基因家族的进化和功能分化机理研究提供了重要的模式和案例,具有重要的理论意义。